微生物实验指导.doc

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1、微生物学实验指导书 微生物学实验指导书二零零六年十月目 录实验一 显微镜油浸系物镜的使用3实验二 细菌形态的观察4实验三 细菌简单染色法及口腔微生物的观察5实验四 细菌的革兰氏染色7实验五 细菌的芽胞染色8实验六 酵母菌的形态观察实验10实验七 霉菌的形态观察12实验八 细菌大小的测定14实验九 细菌数量的测定（血球板计数）16实验十 培养基的配制19实验十一 消毒与灭菌21实验十二 稀释平板计数及微生物菌落形态的观察27实验十三 紫外线对微生物生长的影响30实验十四 抗生素对微生物的作用30实验十五比浊法测定大肠杆菌的生长曲线31实验十六 土壤中好气性细菌的分离与计数(附划线分离法)32实验

2、十七土壤中放线菌的分离与计数35实验十八土壤中真菌的分离与计数36实验十九纤维素分解试验37实验一 显微镜油浸系物镜的使用一、实验目的和实验内容目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法内容：1、学习油浸系物镜的使用方法2、用油镜观察细菌三型和放线菌染色装片二、实验材料和用具细菌三型、放线菌的染色装片，香柏油、二甲苯，显微镜、擦镜纸。三、操作步骤（一）观察前的准备1、将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距离实验台边沿约4厘米。坐正，练习用左眼观察。2、调节光源：将低倍镜转到工作位置，将光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约一微米左右。转动反光镜采集

3、光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。（二）低倍镜观察染色装片首先上升镜筒，将细菌三型染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距离装片0.5厘米处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物象时，改用细调节器调节到物象清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。（三）高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适

4、宜。用细调节器校正焦距使物象清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。（四）油镜观察1、提起镜筒约2厘米，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。2、从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩散为止，镜头几乎与玻片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。3、将光圈调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升（切忌反放向旋转），当视野中出现物象时，改用细调节器调节到物象清楚为止。如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物象，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物象看清为止。仔细观察并绘图。4、再次观察 提起

5、镜筒，换上放线菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。（五）镜检完毕后的工作1、 提起镜筒，或降下载物台2、 移开物镜镜头3、 取出装片4、 清洁油镜 油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。5、 擦净显微镜，将各部分还原。将物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。四、注意事项1、使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察的程序操作。2、下降镜头时，一定要从侧面注视，

6、切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。3、使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。4、注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。五、演示如何使用油镜观察染色装片的要点，如滴油、下降镜头、调焦、擦拭镜头等六、实验报告分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率七、问题和思考1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2、使用油镜时，为什么必须用镜头油？3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜

7、观察？实验二 细菌形态的观察一、实验目的和实验内容目的：巩固油镜的使用；掌握细菌形态观察的基本方法，了解细菌的基本形态内容：1、观察细菌的基本形态染色装片2、观察枯草芽孢杆菌活菌3、观察细菌细胞结构的染色装片二、实验材料和用具大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌；变形菌装片三、操作步骤（一）、观察细菌的基本形态用低倍镜、高倍镜和油镜观察大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、变形菌的染色装片，并分别在油镜下绘图（二）、观察枯草杆菌活菌 常用压滴法：1、 将洁净无油腻的载片放于自己正前方，在中央放一滴无菌水2、 将酒精灯放于自己正前方，点燃3、 用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上

8、的随地充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架4、 用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。如菌液过多，可用吸水纸吸去一部分。5、 先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗一些。四、注意事项1、 注意擦镜头时，只能用擦镜纸2、 观察完毕，必须将镜筒上升，才能取下装片，放入另一装片后，要按使用油镜要求，重新操作，不能在油镜下直接取下和替换装片3、 无菌操作过程中，接种环美军后不能触及其他物品，挑菌不能过多五、演示1、 细菌细胞结构装片示范镜2、 无菌操作过程3怎样盖盖玻片才不产生气泡。 六、实验报告(一) 绘图1 绘出你所观察到的

9、几种细菌的个体形态视野图2 绘出你所观察到的细菌细胞结构视野图，并注明各部分(二) 试指出在制备活菌装片时，应注意什么问题?七、 问题与思考1用明视野显微镜观察细菌的形态时，你认为用染色装片好，还是用非染色的活体装片好，为什么?观察活体装片与染色装片，光线调节各有什么不同?2无菌操作过程中，可否将棉塞放在桌面上?为什么?实验三 细菌简单染色法及口腔微生物的观察一、试验目的和实验内容目的：巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术，了解口腔中的微生物及其观察方法。内容：1、细菌单染色操作技术2、染色法或负染色法观察口腔中的微生物二、实验材料和用具 大肠杆菌(Ecoli)、金黄色葡萄球菌(Sta

10、phylococcusaureus)的斜面菌种。 吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。三、操作步骤（一）单染色法1、涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约115Cm2(图71A、B)。2、干燥 将涂片于室温中自然干燥3、固定 手执载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火23次。在火上固定，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图71 C)。4、染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂

11、菌处，染色约2rain(图71D5、水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图71 E)。6、干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体(图71F)。7、待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用拍图71 负染色的推片方法(二)口腔微生物的观察1、 单染色法(1)在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，涂成薄膜。(2)将涂片于室温中自然干燥后，按上面单染色法的步骤，进行固定、染色、水洗，干燥后镜检。2负染色法(1)在洁净无油腻的载片的一端滴一小

12、滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，然后加少许黑色素溶液，充分混匀。(2)另取一载片将其边缘放在含菌载片的一端，然后推向另一端，则含菌载片上的混合液被推成薄膜。(3)于室温中自然干燥。(4)镜检：将光线调亮，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。四、注意事项载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄五、演示1单染色的主要步骤。 ；2负染色的推片方法。六、实验报告（一）绘图1、 单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图2、 你所观察到的口腔微生物的形态图，并注明使用的染色方法，菌体和背景的颜色3、 你所观察到的口腔微生物的形态图，并注明使用的染色方法，菌

13、体和背景的颜色。（二）单染色法和负染色法操作要点。七、问题和思考 1涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题? 2制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察? 3你知道口腔中通常存在哪些微生物吗?如何进行区分? 实验四 细菌的革兰氏染色一、 实验目的和内容 目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤内容：1制作细菌染色装片。2进行革兰氏染色法操作二、 实验材料和用具金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Ecoli)菌液，待测菌菌液12种。革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯

14、、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、试管、小滴管三、 操作步骤（一）制片1涂菌 用无菌操作方法从试管中沽取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌2干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。3固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。(二)染色 1初染 于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。 2媒染 滴加卢戈氏碘液，1min后水洗。 3脱色 滴加95乙醇脱色，摇

15、动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚度需时30s至lmin)，水洗。 4复染 滴加番红（石炭酸复红）液复染1min，水洗。 5用滤纸吸干，油镜镜检。(三)结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。(四)检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。四、注意事项 1涂片务求均匀，切忌过厚。 2在染色过程中，不可使染液干涸。 3脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌。4老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。五、演示制片方法及染色过程。六、实验报告 (一)绘图 1大肠杆菌革兰氏染色视野图。 2金黄色葡萄球菌革兰氏染色视

16、野图。 (二)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。（三）未知菌的检测结果。七、问题和思考 1涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么? 2什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么? 3试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。 实验五 细菌的芽胞染色一、实验目的：学习细菌的芽胞染色法二、实验原理：细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，

17、芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。三、实验材料1.活材料：培养36小时的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）。2.染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液见附录二（一）6、5。3.器材：小试管（75mm10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。四、实验方法1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法（1）制备菌液：加12滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取23环的菌

18、体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液23滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。（3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热1520min。（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。（7）复染：加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。2.Schaeffer与Fulton氏染色法（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。

19、（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过23次。（3）染色：加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持15-20min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。复染：用蕃红液染色5min。（4）水洗、晾干或吸干。（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。五、实验作业：绘出所用材料的芽胞和菌体的形态图。六、注意事项1. 供芽胞染色用的菌种应控制菌龄。2. 改良

20、法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。3. 用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。实验六 酵母菌的形态观察实验一、 实验目的和内容：目的：了解自然存在的酵母菌及其形态结构。了解酵母菌产生子囊孢子的条件及其形态内容：1观察酵母菌个体形态。 2观察酵母菌的假菌丝和繁殖过程。3观察自然状态的酵母菌。二、实验材料和用具 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)斜面菌种。 PDA培养基

21、、麦氏(McCLary)培养基(醋酸钠培养基)、005美蓝染色液(以pH 60的002molL磷酸缓冲液配制)、碘液、004的中性红染色液、5孔雀绿，05沙黄液、95乙醇。显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、V形玻璃棒、放置一个三角形玻璃棒支架的培养皿。三、操作步骤 (一)酵母菌形态观察1酵母菌的活体染色观察及死亡率的测定(1)以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。(2)取005美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色23min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。(3)在一个视野里

22、计数死细胞和活细胞，共计数56个视野。 酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算： 死亡率=死细胞总数/死活细胞总数（%）2酵母菌液泡系的活体观察 于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少许上述酵母菌悬液与之混合，染色5min，加盖玻片在显微镜下观察。细胞无色，液泡呈红色。3酵母菌细胞中肝糖粒的观察 将1滴碘液置于载玻片中央，接入上述酵母菌悬液，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色。4酵母菌子囊孢子的观察 (1)活化酿酒酵母：将酿酒酵母接种至新鲜的PDA培养基上，置28C培养23d，然后再移植23次。 (2)移接产孢培养基：将活化的酿洒酵母移接至醋酸钠培养基上，置

23、30C恒温培养14d。 (3)观察：挑取少许产孢菌苔于载玻片的水滴上，经涂片、热固定后，加数滴孔雀绿，lmin后水洗，加95乙醇30s，水洗，最后用o5沙黄液复染30s，水洗去染色液，最后用吸水纸吸干。制片干燥后，镜检，子囊孢子呈绿色，子囊为粉红色。注意观察子囊孢子的数目、形状和子囊的形成率。 (4)计算子囊形成的百分率：计数时随机取3个视野，分别计数产子囊孢子的子囊数和不产孢子的细胞，然后按下列公式计算： 子囊形成率() 三个视野中形成子囊的总数/三个视野中（形成子囊的总数加不产豹子细胞总数） XlOO5酵母菌假菌丝的观察 取一无菌载玻片浸于溶化的PDA培养基中，取出放在湿室培养的支架上，待

24、培养基凝固后，进行酵母菌划线接种，然后将无菌盖玻片盖在接菌线上(图131)，28培养23d后，取出载玻片，擦去载玻片下面的培养基，在显微镜下直接观察。可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝，裂殖酵母则形成竹节状假菌丝(图132)。 i6自然状态下的酵母菌观察 取一滴美蓝染色液于载玻片中央，春夏秋季取酱油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜汤上的白膜，将其置于载玻片染色液中，盖上盖玻片，显微镜下仔细观察酵母菌形态，出芽生殖，假菌丝等。 图131 酵母菌假菌丝的培养 图132 酵母菌的假菌丝形态B 藕节状假菌丝； B竹节状假菌丝四、注意事项1、用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润。2、在产孢培养基上加大

25、移种量，可提高子囊形成率。3、通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。五、演示1酵母菌子囊及子囊孢子，酵母菌假菌丝的示范镜。2假菌丝培养的操作过程。六、实验报告(一)绘图1数个酵母菌细胞，示观察到的结构。2数个子囊及子囊孢子形态图。(二)记录并计数酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始记录及计算结果)。七、问题和思考 1酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别?2如何区别营养细胞和释放出的子囊孢子?3试设计一个从子囊中分离子囊孢子的试验方案。注： 酵母菌的简易培养 配2葡萄糖水(或白糖水)，煮沸，装入三角瓶中(液面高度23cm)，加HCl调至pH34，放人几块葡萄皮(或其他糖分较高的

26、果皮)，置2528温箱中培养2-3d，闻到酒香味后，即可取培养液镜检。实验七 霉菌的形态观察一、实验目的和内容目的：了解霉菌形态，掌握微生物载玻片湿室培养方法。内容：1霉菌载玻片湿室培养。 2曲霉、青霉、根霉、毛霉形态观察。3根霉假根的观察。二、实验材料和用具 产黄青霉、黑曲霉、黑根霉、总状毛霉等斜面菌种。 半固体PDA培养基、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20甘油。 透明胶带、剪刀、培养皿、门形玻棒搁架、盖玻片、圆形滤纸片、细口滴管、镊子、显微镜、接种环、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、吸水纸等三、操作步骤(一)霉菌的载玻片湿室培养可4人合作，每人制作一霉菌的载玻片。1准备湿室 在培养皿底铺一

27、张圆形滤纸片，其上放一“门”形载玻片搁架，在搁架上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎，经121湿热灭菌30min后，置60烘箱中烘干，备用。2取菌接种 用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。3加培养基 用无菌细口滴管吸取少量融化约60的培养基，滴加到载玻片的接种处，培养基应滴得圆而薄，其直径约为05cm(滴加量一般以1Q小滴为宜)。4。加盖玻片 在培养基未彻底凝固前，用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上、用镊子轻压，使盖玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁，

28、否则不透气。5倒保湿剂 每皿倒人约3mL20的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润湿，以保持皿内湿度。皿盖上注明菌名、组别和接种日期。此为制成的载玻片湿室，置28C恒温培养35de(二)黑根霉假根的培养 将融化的PDA培养基，冷却至50C倒入无菌平皿，其量约为平皿高度的1超。冷凝后，用接种环沾取根霉孢子，在乎板表面划线接种。然后将平皿倒置，在皿盖内放一无菌载玻片，于28培养23d后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构(图141)。(三)镜检观察 1湿室培养霉菌镜检载玻片 从培养1620h开始，通过连续观察，可了解孢子的萌发、菌丝体的生长分化和

29、子实体的形成过程。将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。绘图。 2粘片观察 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。 3假根观察 将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。 4制成永久装片 把观察到霉菌形态较

30、清晰，完整的片子，制成标本作较长期保存。制备方法是，轻轻揭去盖玻片，如果载玻片上有琼脂，仔细挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，盖上清洁盖玻片，在盖玻片四周滴加树胶封固。 四、注意事项 载玻片湿室培养时，盖玻片不能紧贴载玻片，要彼此有极小缝隙，一是为了通气；二是使各部分 结构平行排列，易于观察。 五、演示 14种霉菌制片的示范。 2载玻片湿室培养方法。 六、实验报告(一)绘制镜检形态图 1、 毛霉和根霉形态图，示各部2、 青霉和曲霉形态图，示各部（二）载玻片观察纪录各菌种的载玻片标本观察结果菌种菌丝体（气生菌丝、营养菌丝的粗细、色泽，菌丝有隔或无隔等）无性菌丝特征（孢子梗的分化特征，孢子着生特征

31、等）其他特征结构（有无假根、足细胞、匍匐菌丝、囊轴等七、问题和思考1、 什么叫载玻片湿室培养？它适用于观察什么样的微生物，有何优点？2、 湿室培养时为何用20%甘油作保湿剂？3、 本实验中观察假根的设计原理是什么？此设计还适用于培养那些菌？实验八 细菌大小的测定一、实验目的和实验内容目的：学会测微尺的使用和计算方法及对球菌和杆菌的测量内容：1、认识测微尺，学习目镜测微尺的标定2、测定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌体的大小二、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的玻片标本；香柏油、二甲苯、显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸、吸水纸等三、操作步骤1、测微尺的构造 显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜

32、台测微尺组成，目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm刻尺上分50份（图15-1B）。目镜测微尺每个实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。镜台测微尺为一专用中央有精确等分线的载玻片（图15-1A），一般将长为1mm的直线等分成100个小格，每格长0.01mm即10um，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。2目镜测微尺的标定 把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放人目镜的隔板上，使有别度的一面朝下。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度

33、与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线(图151B)。3计算方法 ： 标定公式：目镜测微尺每格长度/um=两条重合线间镜台测微尺的格数*10/两条重合线间目镜测微尺的格数 例如，目镜测微尺20个小格等于镜台测微尺3小格，已知镜台测微尺每格为10um，则3小格的长度为3*10=30um，那么相应地在目镜测微尺上每小格长度为3X1020=15(um)。用以上计算方法分别校正低倍镜、高倍镜及油镜下目镜测微尺每格实际长度。4菌体大小的测定 将镜台测微尺取下，分别换上大肠杆菌及金黄色葡萄球菌玻片标本，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测

34、量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。并详细记录于表151中。 一般测量菌体的大小，应测定1020个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。四、注意事项 1镜台测微尺的玻片很薄，在标定油镜头时，要格外注意，以免压碎镜台测微尺或损坏镜头。2标定目镜测微尺时要注意准确对正目镜测微尺与镜台测微尺的重合线。五、演示 1、目镜测微尺、镜台测微尺的显微镜下示教。 2、标定及测量方法示范。 六、实验报告 1目镜测微尺标定结果： 低倍镜下_倍放大倍数，目镜测微尺每格长度是_um。 高倍镜下_倍放大倍数，目镜测微尺每格长度为_um。 油镜下_倍放大倍数，测

35、微尺每格长度是_um。 2菌体大小测定结果： 大肠杆菌测定结果 金黄色葡萄球菌的直径大小测定结果苗号 目镜测微尺格数 实际长度 目镜测微尺格数 实际直径出) 宽 长 宽 长 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 均值试与已知的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的大小作一比较是否一致?为何? 七、问题和思考 1。为什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时必须重新用镜台测微尺对目镜测微尺进行标定? 2。若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么目镜测微尺每格所测量的镜台上的菌体细胞的实际长度(或宽度)是否相同?为什么?实验九 细菌数量的测定（血球板计数）一、实验目的和内容目的：掌握细菌数量的测定方法和综合

36、性设计性实验探究。 内容：1计数板直接镜检计数。 2载玻片直接镜检计数。 3平板菌落计数。二、实验材料和用具 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)斜面培养物(约培养l0h)、培养57d的大肠杆菌(Ecoli)菌液。 牛肉膏蛋白胨培养基、美蓝染色液、结晶紫染色液、香柏油、二甲苯、无菌水。 显微镜、血细胞计数板、手动计数器、酒精灯、无菌吸管、滤纸条、载玻片、盖玻片、无菌微量移液管、接种环、擦镜低、无菌试管、涂布器、无菌培养皿。三、操作步骤(一)计数板直接镜检计数 1血细胞计数板的构造血细胞计数板由四条平行槽构成3个平台，中间的平台较宽，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台面各有一个含9

37、个大格的方格网，中间大格为计数室。计数室的长和宽各为lmm，中间平台下陷01mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为01mm3。血细胞计数板的构造见图16。常见血细胞计数板的计数室有两种规格。一种是16X 25型，称为麦氏血细胞计数板，共有16个中格，每个中格分为25个小格。另一种是25X16型，称为希里格式血细胞计数板，共有25个中格，每个中格又分成16个小格。但是不管哪种规格的血细胞计板其计数室的小格均由400个小方格组成。应用血细胞计数板在显微镜下直接计算微生物细胞的数量，方法是先测定若干个方格中的微生物细胞，再换算成每mL菌液(或每g样品)中微生物细胞数量。 2细菌数量的测定 (1)稀释加样

38、；取枯草芽孢杆菌斜面少量菌体至100mL无菌水中，稀释混匀后待用(浓度约为104105mL)。先将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取以上稀释液滴于盖玻片的边缘，让菌液自行渗入，多余菌液用滤纸吸去，稍待片刻，待细菌细胞全部沉降到计数室底部，将计数板放于载物台的中央，按下列步骤寻找计数室并计数。 (2)找计数室：先在低倍镜下寻找计数板大方格网的位置，转换高倍镜后，调节光亮度至菌体和计数室线条清晰为止，再将计数室一角的小格移至视野中。顺着大方格线移动计数板，使计数室位于视野中间。 (3)计数：计数时，如用16X25型计数板则按对角线方位，取左上、右上、左下、右下4个大格(共4个大格，100个小格)内的细

39、胞逐一进行计数；如使用规格为25X16型的计数板，则除取左上、右上、左下、右下4个大格外，还需加中央的一个大格(共5个中格，80个小格)内的细胞。计数时当遇到大格线上的细菌时，一般只计此大格的上方及右方线上的细胞(或只计下方及左方线上的细胞)，将计得的细胞数填入结果表中，对每个样品重复计数3次，取其平均值，按下列公式计算每mL菌液中所含的细菌细胞数。16X25和25X16型血细胞计数板的计算公式(二)载玻片直接镜检计数 1摇动菌液使其混合均匀，用无菌微量移液管取菌液001mL于载玻片上，并用无菌接种环均匀地涂布在1cm2的面积上。风干，固定，结晶紫染色1min，冲洗，干燥备用。 2用物镜测微尺

40、，测量显微镜油镜观察时的视野直径，并以S=r2公式，计算出视野面积。 3将涂片置于载物台，滴香柏油，以油镜观察，不断变化视野，共观察10个视野，计数每一视野中细菌个数。以下列公式计算每毫升菌液中的含菌数量。(三)平板菌落计数 另取灭菌移液管吸取上述枯草芽孢杆菌稀释液lmL，放人已灭菌的培养皿中，再倒人融化而冷却到5012左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基同时制作3个平板，皿中铺成一薄层，并使乎皿作前后和左右滑动，使样品和培养基混匀，待其凝固后倒置，37C培养24h后计算菌落数，并计算其每mL的含菌量。 四、注意事项 直接镜检计数完毕，用蒸馏水冲洗计数板。绝不能用硬物洗刷。洗后待其自行晾干，或用滤纸沾

41、干。最后用擦镜纸擦干净。若计数是病原微生物，则需先浸泡在5的石炭酸溶液中进行消毒，然后再进行清洗。五、演示 1显微镜下显示计数板计数室。 2平板菌落计数操作过程。六、实验报告 (一)记录实验结果1 计数板直接镜检计数结果：计算次数 各大格中细胞数大格中细胞总数稀释倍数总菌数/个*mL-1或个*g-1左上右上右下左下中间 第一次 第二次 第三次 平均值2涂片直接镜检计数结果 视野12345678910 平均视野 待测样品/ml*g-1 菌数3平板菌落计数结果： 总菌数/个mL-1或g-1=每皿平均菌落数X稀释倍数 (二)比较以上3种不同计数方法所得的结果并进行分析。 七、问题和思考 1根据你的体

42、会，血细胞计数板计算的误差主要来自哪些方面?应如何减少误差? 2比较各种计数法的优点和缺点。 3。设计一个方案，如何计数市售酸奶或三株口服液或菌肥制品的单位含菌数。实验十 培养基的配制一、实验目的和内容目的：学习和掌握配置培养基的一般方法和步骤内容：1、牛肉膏蛋白胨的配制2、高氏1号培养基的配制3、马丁氏培养基的配制二、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/l NaOH、1mol/l HCl、KNO3、NaCl 、K2HPO4*3H2O、MgSO4*7H2O、 FeSO4*7H2O。试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛

43、皮纸、记号笔、线绳、纱布三、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂1520g，水1000ml，pH7.47.61、称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯，牛肉膏极易吸潮，故称量时要迅速。2、加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失水分。3、调pH 检测培养基的pH，若偏酸，可滴加1mol/l NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/l HCl进行调节。PH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不可调过头，以免调回影响培养基内各离子的浓度4、过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，这步可以省略。5、分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，