实验室菌种的使用和管理.doc

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1、xxx食品检测中心作业指导书 1.目的规范实验室菌种的收集、使用、保管程序；确保实验室的安全。2.范围本管理细则适用于实验室菌种的使用和管理。3.职责3.1菌种保管员：按照本指导书做好菌种的收集、转种、使用、保存和发放以及销毁工作。3.2科室负责人：负责监督菌种的使用及管理。4.管理细则本实验室保存的菌种仅包括一部分致病性较弱的三类细菌、一部分无致病能力的普通细菌和常见真菌。不包括病毒、螺旋体、衣原体、立克次体；保存的菌种主要用于各类培养基、检测试剂的性能测试和质量控制。4.1在本实验室保管的菌种名4.1.1保留工作菌种：大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌50013、福氏志贺氏菌2a

2、ATCC12022、副溶血性弧菌200904-1、金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228溶血性链球菌23310、铜绿假单胞菌10211、普通变形杆菌，克雷伯氏杆菌，小肠结肠炎耶森氏菌ATCC 23715 、单核增生李斯特菌ATCC19111、 枯草芽胞杆菌ATCC6633b 、蜡状芽胞杆菌ATCC11778、白色念珠菌ATCC10231、酿酒酵母ATCC9763、 黑曲霉菌 、展青霉菌 、 黄曲霉菌。4.1.2常规检测,科研分离得到的有保留价值的三类/四类菌种根据需要可继续保留；如果在食品中分离到二类/一类菌种,及时送上级单位进一步鉴定,并按规定立即销毁。本实验室不保

3、存一类、二类菌种。4.2 菌种的保管4.2.1实验室菌种保存于专用的菌种室。4.2.2菌种保管员及科室负责人双人双锁负责保管菌种。4.2.3使用菌种需提出申请、经科室负责人批准后，向菌种保管员领用。4.2.4菌种应按规定的时间定期转种，一般每转种3代做一次鉴定，如发现污染或变异应及时处理。4.2.5保管人员工作变动时应作好交接工作。4.3 菌种的使用和保存4.3.1菌种的类别4.3.1.1实验室内的标准菌种根据用途不同，分为储存菌种、传代用菌种和工作用菌种。储存菌种：以冷冻干燥保藏为主，用于菌种的长期保存，一般是从菌种保藏中心或专业实验室购买得到的标准菌株，用符号S表示。一般可保存5年。传代用

4、菌种：采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法，用于菌种的传代，用符号G表示。甘油冷冻管保藏法一般可保存2年；工作菌种：保存于半固体内或琼脂斜面培养基中，作为工作用菌种，用符号W表示。一般可保存12个月。4.3.1.2实验室从样品中分离得到的菌株用符号Y表示。4.3.2菌种的接收菌种购到实验室后，应在菌种接收记录上填写所购菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。贴好标签后储存于-30以下。4.3.3冷冻干燥菌种的恢复培养 按菌种保藏中心的要求进行恢复培养。中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)建议的方法如下：安瓿管开封：用浸过70酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰将安瓿管顶端加热，滴无菌水至加

5、热的安瓿管顶端使玻璃开裂，用锉刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。 菌株恢复培养：用无菌吸管，吸取0.3-0.4ml适宜的液体培养基（如营养肉汤），滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，取约0.2ml菌体悬浮液，移植于指定的琼脂斜面/平板培养基上，剩余的菌液，注入指定的液体培养基内（3-4ml），然后在建议的温度下（一般培养温度32.52.5，1824h）培养。 注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在5-10的环境下；某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。4.3.4菌种的传代从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。按转种次数确定菌种的代数：冷冻干燥的

6、菌种在液体培养基内恢复培养（第1代）后，转种至平板培养基上得到单个纯菌落，此为第2代。菌种传代一般不超过5代。鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，此作为第2代传代用菌种（G2）；同时挑取纯菌落转接斜面，此菌种作为工作用菌种，为第3代（W3）。将第2代传代用菌种（G2）管冷冻保存（-30以下），将第3代工作用菌种（W3）以适当温度下培养适当时间后可用于实验。取一支冷冻保存的第2代传代用菌种（G2）转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成甘油冷冻管，为第3代传代用菌种（G3）；斜面培养基经适当温度下培养适当时间后可用作第3代工作用菌种（W3）

7、。当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如W3可直接转接为W4。按上述程序操作，直至G4转为W5为止，需重新开启安瓿，再重复上述操作程序保藏和使用菌种。4.3.5菌种的保存方法4.3.5.1甘油冷冻管保存法甘油冷冻管保存法适用于保存传代用菌种，一般可保存2年。将待保存用菌种接种至平板或琼脂斜面，经372448h培养后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，移至预先装有无菌蒸馏水的试管中，调整菌液浓度，使其等同于1单位麦氏比浊管。向已制备好的菌悬液中加入等体积，浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装于无菌小试管中，在-30条

8、件下贮存。4.3.5.2液体石蜡覆盖保藏法液体石蜡覆盖保藏法适用于保存传代用菌种，一般可保存3-6个月。取纯化菌种穿刺接种于半固体培养基中，经371824h培养后，加无菌液体石蜡覆盖半固体表面（高度1厘米为宜）。石蜡油封存以后，放入4冰箱中保存，也可直接放在低温干燥处保藏。肠道细菌、葡萄球菌一般可保存3-6个月；保存O1群和非O1群霍乱弧菌时宜放置室温阴暗处；保存副溶血性弧菌时，用含3.5%氯化钠半固体，宜放置室温阴暗处；保存葡萄球菌、链球菌可用10%血半固体。4.3.5.3斜面低温保存法斜面低温保存法适用于保存工作用菌种，一般可保存12个月取纯化菌种转接种于适宜的固体斜面培养基上，经3718

9、24培养后，用纸将管塞部分包扎好，放入4冰箱中保存，也可直接放在低温干燥处保藏。4.4 菌种的实验室编号编号原则：菌种名称+类别/传代次数-制备日期或接收日期，例副溶-G3-20081213。对于实验室从样本中分离得到的菌种，类别用Y表示，例副溶-Y3-20081213。注：菌种名称使用中文简称，如“副溶血性弧菌”用“副溶”表示；“金黄色葡萄球菌”用“金葡”表示；“奇异变形杆菌”用“奇变”表示。4.5 菌种的销毁4.5.1 菌种销毁采用高压蒸汽灭菌：121，20分钟。4.5.2 下列菌种需及时销毁处理：发生污染或变异的菌种；超过保存期限的菌种；使用后的菌种。5.记录表式菌种接收记录表 菌种使用

10、登记表 菌种销毁审批表 6.参考文献6.1 戴光强 医学继续教育系列丛书卫生检验分册M合肥：安徽科学技术出版社，2001.46.2 管远志， 王艾琳，李坚管医学微生物实验技术M北京：化学工业出版社，200586.3 王宏明微生物检验技术操作规程与质量控制及检测数据分析处理实用手册M北京：卫生科技出版社，2007.56.4 汪穗福微生物检测验证技术M 北京：北京医药科技出版社，2005.5附件1-菌种的分类医学上常见菌种的分类菌种的分类根据其危险性决定（包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染

11、、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况）。依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。一类：实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。如：鼠疫耶尔森氏菌、霍乱弧菌（包括EL-tor弧菌）等。二类：实验室感染机会较多、感染后的症状较重及危及生命，发病后不易治疗及对人群危害较大的传染病菌种。如：布氏菌、炭疽芽胞菌、肉毒梭菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌等。三类：仅具有一般危险性，能引起实验室感染的机会较少，一般的微生物学实验室采用一般实验技术能控制感染

12、或有对之有效的免疫预防方法的菌种。如：葡萄状球菌、链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、李斯特氏菌和铜绿色假单孢菌等；四类：生物制品、菌苗、疫苗生产用各种减毒、弱毒菌种及不属于上述一、二、三类的各种低致病性的微生物菌种。附件2-微生物菌种保藏机构名称和缩写微生物菌种保藏机构名称和缩写中国缩写 名 称ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所SH 上海市农业科学院食用菌研究所CACC 抗菌素菌种保藏管理中心IA 中国医学科学院抗菌素研究所SIA 四川抗菌素工业研究所CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心AS 中国科学院微生物研究所AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心CICC 工业微生物菌种保藏管理中心IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心ID 中国医学科学院皮肤病研究所NICPB 卫生部药品生物制品监察所IV 中国医学科学院病毒研究所CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心CIVBP 中国兽医药品监察所YM 云南省微生物研究所国外缩写 名 称ATCC 美国标准菌种保藏所，美国马里兰州，罗克维尔市CBS 真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市NCTC 国立标准菌种保藏所，英国，伦敦