国家自然科学基金标书－集成微流控芯片纳米材料制备与分析应用研究.doc

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1、集成微流控芯片纳米材料制备与分析应用研究申请人: *摘要本项目提出用流体动力学聚焦法在集成微流控芯片的微管道中合成金属, 有机导电聚合物及它们的核/壳结构的纳米颗粒, 并在线对纳米颗粒表面进行修饰与功能化. 然后用于样品标记, 实现在这一集成芯片上完成纳米颗粒合成, 修饰, 标记, 样品分析.AbstractThe project proposes synthesizing various nanoparticles (NPs) such as metal NPs, conducting polymer NPs, and core/shell NPs in the microchannel o

2、f an integrated microfluidic chip by means of hydrodynamic focusing and on-line functioning those synthesized NPs. Then the use of these functionalized NPs directly to label the analyte of interest from samples and completing synthesis, modification, labeling and detection on the integrated microflu

3、dic system. 重要意义本项目利用微流控芯片合成纳米颗粒并在同一芯片上集成纳米材料合成系统与样品分析系统,实现同一芯片完成纳米材料合成, 在线标记与样品检测. 将纳米分析技术与微流控芯片分析有机结合, 由于纳米材料的独特的功能与性质, 从而大大提高了芯片分析的灵敏度, 同时不失芯片分析具有的其他优点. 本项目提出的微流控芯片集成电分析化学技术将实现该芯片分析仪的微型化, 可携带并可用于现场分析. 本项目提出的利用流体动力学原理调控纳米材料的合成等方面的基础研究, 对于纳米材料的形成机制及其结构特征也将富有成果. 因此, 本项目的研究将为促进新一代微流控芯片分析的出现和发展有积极和重要意

4、义.目前研究现状集成微流控芯片, 通称为芯片实验室, 是指把生物, 环境和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成在一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术.1, 2 它是在1990年提出的微全分析系统概念的基础上发展起来的.3 目前, 芯片实验室分析已成为一个非常热门的研究领域.4-9 它之所以倍受人们关注是因为其特点所决定的: (一), 集成性.10 集成的单元部件越来越多，集成的规模也越来越大, 功能也越来越强; (二), 分析速度极快;11 (三), 高通量;10, 11 (四), 微型化可携带,

5、适于即时, 在线与现场分析; (五), 能耗低，物耗少，污染小因而非常廉价，安全, 被人为是一种环境友好的分析方法与“绿色”技术. 因此，芯片实验室研究显得非常重要. 例如, 在生物医学领域, 它可以使珍贵的生物样品和试剂消耗降低到微升甚至纳升级，而且分析速度成倍提高，成本成倍下降; 在化学领域它可以使以前需要在一个实验室花大量样品、试剂和很多时间才能完成的分析和合成，将在一块小的芯片上花很少量样品和试剂以很短的时间同时完成大量实验;在分析化学领域，它可以使以前大的分析仪器变成平方厘米尺寸规模的分析仪，将大大节约人力与物力资源和能源. 在环境领域, 它使现场分析及遥控环境分析成为可能.芯片实验

6、室是一个跨多学科的研究领域, 它涉及物理, 化学, 工程, 医学等. 因而研究的范围非常广泛. 不同的学科研究的侧重点可能不一样. 分析化学家侧重于把芯片实验室用做全分析系统, 而有机化学家则把它用作微反应器用来化学合成. 目前, 芯片实验室主要用于分析,4-7 分离12, 13与化学合成14等领域. 芯片实验室 本身的一些理论和应用基础研究,3 制作工艺研究,15, 16 适用新型材料开发等也在发展之中. 例如, 以芯片制作工艺而言, 芯片制造已由手工为主的微机电(MEMS)技术生产逐渐朝自动化、数控化的亚紫外激光直接刻蚀微通道方向发展, 同时其他技术如, 模板技术(Soft Lithogr

7、aphy)10等也广泛应用起来; 芯片实验室的驱动源从以电渗流发展到流体动力、气压、重力、离心力、剪切力等多种手段. 芯片实验室所用材料由最初的价格较为昂贵的玻璃和硅片，发展成以便宜的聚合物为材料，如聚二甲基硅烷（PDMS）、聚甲基异丁烯酸（PMMA）及其他各种塑料等.芯片实验室在分析与合成研究方面最为广泛. 芯片实验室分析研究主要集中在以下几个方面: 检测技术;17, 18分离技术12, 13与样品制备技术包括取样与进样, 样品处理等; 及分析应用研究等.19, 20目前, 芯片实验室最常用的检测器是荧光21和电化学检测器.18, 22, 23 荧光法的灵敏度高. 但现阶段其体积仍然偏大.

8、芯片的驱动源和检测装置是芯片实验室仪器的主要组成部分，其体积的大小直接决定了芯片分析仪的大小, 因此, 人们正努力追求将这两部分做到最小. 电化学检测由于其体积较小 且灵敏度高，可制成便携式分析仪在尺寸上和芯片实验室的概念匹配，所以在芯片实验室分析中的应用研究较多。电化学检测器的一般做法是将电极集成到芯片上，采用安培或电导法进行检测. 但是一些因素, 如电泳分离电压对检测电流的干扰等, 是电化学检测需要克服的。另外, 其它检测方法也在进入这一领域，如质谱(MS),24 不需标记的SPR检测25、核磁共振(NMR),快速阻抗谱（FIS）检测、NIR时间分辨荧光检测等. 分离技术以芯片毛细管电泳方

9、法研究最多且最为成功, 其他方法也在不断的探索之中. 目前, 与分离, 和检测相比, 在芯片上的样品制备方面的研究还不见多. 但是也在发展中, 如芯片完成取样, 过滤等已见报道.20 芯片实验室分析在许多领域已有应用. 根据统计资料, 在近五年, 芯片实验室分析85%集中于 生物医学领域. 如临床血细胞分析,26核酸分分析,27蛋白质分析,28与药物分析29等; 10%于环境领域30, 如重金属分析31, 化学毒气及爆炸物等; 少于5% 用于食品及其他领域.芯片实验室用于化学合成1, 14也有广泛研究与报道.如常 PCR扩增 .32目前, 制备和开发纳米材料, 如纳米颗粒, 引起了人们的广泛兴

10、趣, 因为这些纳米材料已经在超灵敏分析, 药物释放等显现出了广泛的应用前景. 微流控芯片现在也开始应用于纳米颗粒的合成. 33-36已见的报道有: 硅纳米颗粒,34 半导体纳米颗粒,33, 36 导电聚合物纳米颗粒等. 芯片实验室用于纳米颗粒合成显出它的优势, 即在微管道里容易创造纳米大小的反应空间. 因而反应物在受现的空间里生成纳米颗粒.在现有研究的基础上, 我们提出一种新方法即应用流体动力学聚焦法在微流控心芯片上合成纳米材料如纳米颗粒, 并实现在同一芯片上完成纳米材料合成, 在线标记与样品检测. 这一方法有其优势: 该方法非常简单, 制作工艺也不复杂. 并且实现在同一芯片上完成多项功能包括

11、纳米材料在线合成, 修饰与功能化, 样品纳米颗粒标记与分析; 在这里想特别指出的是: 以前的芯片实验室研究基本上是把分析和合成分割开来. 事实上, 只要找到好的切入点, 则可以把化学合成和分析结合起来, 使化学合成在芯片上为分析服务. 我们在这里提出的微流控芯片材料合成与分析应用就是把合成与分析有机结合起来, 在同一芯片上集成纳米材料合成系统与样品分析系统. 并在微流控芯片分析中引入纳米分析技术, 这将大大提高芯片分析的灵敏度,从而, 促进微流控芯片分析在实际样品分析中的应用. 事实上, 检测技术的灵敏度度是目前芯片实验室分析的重要挑战之一, 这是由于它只用微量样品的结果. 我们在微流控芯片中

12、应用纳米分析技术, 有助于此问题的解决.37研究方法与技术路线流体在微流管道里的流动特性可用以下公式来表征: Re =LVavgr /m式中Re雷诺数, L为长度, m为流体的粘度系数, r为流体的密度, Vavg为流体平均流速. 对于多数微管道, L 为4A/P (这里, A为微管道横截面积, P为管道的润湿参数). 由于微管道的小尺寸, 雷诺数通常大大小于100 甚至小于1.0. 在这个范围, 流体的流动完全是层流状的(见图1), 湍流不会发生. 只有当雷诺数大于2000时, 过渡到湍流才会发生. 因而, 在微管道流体的层流特性为我们提供了一种可以预测和调控子传输迁移的手段.图1. 在不同

13、雷诺数下流体在管道中的流动特性.正是由于流体在微管道中具有这种特性, 我们提出用调控流体动力学的方法, 即流体动力学聚焦法来创造纳米尺寸的反应空间, 让不同的分子通过扩散进入这一纳米空间进行化学反应.由于受限的空间, 纳米颗粒被制备出来. 图2 显示了调控流体动力方法控制反应区间的基本原理. 利用流体动力学原理, 在主管道两侧对称地通入两流体, 通过调控各流体的流动参数, 如流速等, 在主微管道里可形成大小可调控的反应空间(Wf). 这个大小可调控至纳米范围. 因而反应物在受限的纳米空间生成纳米大小的颗粒.另外, 纳米颗粒的大小还可通过控制流体流动的距离d 来控制. 纳米颗粒的大小应与反应物流

14、动的距离成正比. 当然, 这流动距离d 也不能太长. 根据需要可通过实验确定最佳的d值.我们将用PDMS为材料, 利用Soft lithography 技术(见图3)制备集成微流控芯片. 它有多步组成. 我们将设计和制备含有两层微通道的芯片. 在这一芯片中, 其中下层的微通道为主通道, 用于运输样品. 上层的微通道为控制通道,用于控制主通道的样品运输, 具有开和关的功能. 正是在这集成芯片中设有控制通道, 为我们调制芯片上各功能单元提供了条件. 我们将用气压为控制通道提供动力, 在控制通道中装有少部分水. 而流动通道中的动力来自水压或气压. 图2 流体力学控制反应区间示意图图3. 微流控芯片制

15、作程序我们将应用SEM, TEM, XPS, FTIR, 荧光显微镜, 电化学工作站等仪器来研究合成的纳米颗粒. 将微电极与微流控芯片集成, 用电分析化学方法来完成对样品的检测.整个研究项目可分成多步完成. 即先用微流控芯片完成各个单元研究, 成功后在把各个单元集成, 最终实现在集成微流控芯片完成纳米颗粒合成, 修饰, 样品标记与电化学检测.研究内容芯片设计与制备我们将根据不同的要求设计不同的芯片. 以PDMS为材料.用图3显示的方法来制备不同需要的芯片. 金属纳米颗粒制备用微流控芯片研制合成金, 银, 铜等常规金属纳米颗粒. 方法是将金属离子溶液流入主通道, 还原试剂溶液从两侧流入. 通过调

16、节流体参数, 可实现纳米金属颗粒的合成. 一些半导体纳米颗粒即量子点的合成也可通过一系统实现.有机导电纳米颗粒制备用微流控芯片研制合成有机导电聚合物纳米颗粒. 例如, 聚吡咯, 聚苯胺等. 方法也是将单体溶液流入主通道, 氧化试剂溶液从侧通道流入. 通过调节流体参数, 有机导电聚合物纳米颗粒将在微管道中生成, 从而制备机导电聚合物纳米颗粒.功能化纳米颗粒的合成我们进一步提出用微流控芯片及前面谈到的原理实现多步反应, 即将合成的纳米颗粒在同一芯片上实现表面修饰与功能化. 在图2的基础上, 在主通道上下游适当地点增加另一对侧通道, 用于流入修饰试剂溶液, 则可在线实现对前面合成的纳米颗粒表面功能化

17、. 图 4 (A)显示了这一微流控芯片的示意图. 这些功能化集团可以是DNA, 蛋白质, 也可以是荧光团, 胺基,羧基及联合剂集团等(见图4(B).图4. (A)微流控芯片图. (B) 合成的功能化的纳米颗粒.核/壳纳米颗粒制备.我们进一步提出用微流控芯片及前面谈到的原理制备核/壳纳米颗粒. 即将合成的纳米颗粒在同一芯片上进一步均匀沉积一层其它物质. 这在原理上是可行的. 因为新生成的反应产物要首先成核结晶, 由于在这一纳米反应器里, 存在大量的前面合成的纳米颗粒. 所以反应产物将附作在纳米颗粒表面成核结晶. 最终生成核/壳结构纳米颗粒.方法是在图2的基础上, 在主通道上下游适当地点增加另一对

18、侧通道, 用于通入制备壳的反应物溶液. 原则是这些反应溶液不能与前面的溶液参与化学反应. 这样 则可在线制备核壳结构的纳米颗粒并且纳米颗粒表面沉积的厚度可控. 如果想使核/壳表面功能化, 可用前面同样的方法在主通道上下游适当地点在增加另一对侧通道用于流入修饰试剂溶液.纳米颗粒在线标记与分析应用我们首次提出利用微流控芯片实现纳米颗粒在线合成, 修饰, 标记与分析. 图5 显示了这一集成微流控芯片的示意图. 我们将根据选择的纳米材料而选用相应的分析方法. 电分析法和荧光分析法与我们的条件比较适合. 例如, 如果标记的纳米颗粒具有荧光, 则我们可选用荧光分析法. 但是, 荧光分析法一般比较贵, 且不

19、易与微流控新片集成并最终实现微型化, 可携带化目标. 我们提出应用纳米颗粒于微流控芯片的放大分析, 提高分析的灵敏度. 微流控芯片使用的样品量很小, 因而提高微流控芯片分析的灵敏度度是至关重要的.纳米颗粒标记已成功应用于放大的生物分析. 但在微流控分析上的应用还很少. 我们可用电分析化学技术实现样品的分析检测.这样图5. 微流控芯片纳米颗粒在线合成, 修饰, 标记与分析示意图微流控装置将与电极有机集成, 实现电化学检测. 事实上, 目前, 电化学分析是微流控芯片分析应用和研究最多的方法之一. 这是由于以下的原因:(1) 目前的微加工技术很容易实现电极与微流控装置的集成.(2) 电化学分析简单,

20、 费用底, 非常节能.(3) 电化学装置已微型化, 这与微流控芯片非常相配. 因而实现整个分析装置的微型化, 自动化, 可携带化. 最终可实现即时, 在线, 与现场分析.这里着重谈一下标记方法. 可用两种方法:(1) 直接标记分析对象, 以蛋白质分析为例, 我们可在纳米颗粒表面修饰NHS集团(见图3中功能化纳米颗粒), 该集团能与蛋白质的胺基生成肽键而将纳米颗粒标记在靶分子上. (2)间接标记, 以免疫分析为例, 我们可将纳米颗粒标记在第二个抗体上. 用抗体/抗原/抗体Sandwich结构, 实现对抗原的分析. 总之, 可根据实际需要而选用适当的标记方法. 在电极表面修饰特定分子, 该分子能选

21、择性的识别靶分子. 由于靶分子上标记有电活性的纳米颗粒, 从而可实现用电化学技术灵敏地分析样品中的靶分子.研究目标(1) 在集成流控芯片完成合成各种不同类型的纳米颗粒, 如无机纳米颗粒(金, 银, 铜等), 有机导电纳米颗粒(聚吡咯, 聚苯胺等) 及核/壳纳米结构.(2) 弄清纳米材料在微通道中受控环境下的形成机制.(3) 多功能集成并实现各功能单元的有机联结. 在同一芯片上完成纳米材料合成, 修饰, 在线标记并实现电化学检测.(4) 应用纳米技术, 提高芯片分析的灵敏度与选择性.(5) 将研制的集成微流控芯片用于生物分析或环境分析技术.(6) 实现集成微流控芯片高通量与灵敏检测并应用于实际的

22、生物样品和环境样品的分析.本项目的创新性1. 提出在微流控管道中利用调控流体动力学方法, 即流体动力学聚焦法创造纳米反应空间,合成各种类型(如金纳米颗粒, 聚吡咯纳米颗粒)的纳米材料 及包/壳结构纳米材料.2. 将化学合成与分析结合起来, 并在线实现合成纳米颗粒为分析服务.3. 实现在同一芯片上纳米材料在线合成, 修饰与功能化, 样品纳米颗粒标记与分析;4. 在微流控芯片分析中引入纳米分析技术, 从而提高芯片分析的灵敏度本项目须解决的关键问题1.芯片上各个功能单元的有机联接2. 微管道的钝化, 即防止分析物及纳米颗粒在管道壁上的物理吸附. 我们将利用PEG来修饰管道壁以减少非特意性吸附.本项目

23、可行性本项目申请人系中南民族大学教授, 曾有在海外留学和工作经历. 长时间从事生物传感器/生物芯片的开发与研究工作. 特别是在制备和开发功能化纳米材料方面卓有成绩. 申请人在微流控芯片方面也有相当长的研究经历. 并拥有相关专利. 申请人提出的集成微流控芯片制备导电聚合物纳米线曾引起国际上的关注并特邀参加了美国Sandia国家实验室举办的集成微流控芯片国际会议. 中南民族大学将投入大量资金建立实验室包括微加工与超净实验室等. 另外, 本校建有部级的材料化学重点实验室, 大量仪器设备可供本项目研究之用. 初步研究成果1. 利用流体力学法合成导电聚合物纳米颗粒 2.图6 (a) 微流控芯片聚吡咯纳米

24、颗粒合成平面示意图. (b) 图 通过流体动力学聚焦法在微流控芯片管道中合成的聚吡咯纳米颗粒SEM图像.我们用PDMS为材质制备了了初级的微流控芯片(见图6a). 并利用这一芯片成功合成了聚吡咯纳米颗粒. 图6 (b)显示了这种纳米颗粒的SEM图像. 从此图可以看出, 聚吡咯颗粒的直径约20 纳米 并且大小分布基本均匀. 通过调控流体参数, 将可获得更均匀颗粒. 我们将进一步优化和设计新的微流控芯片以满足更复杂与多元集成的需要.3. 集成微流控芯片制备导电聚合物纳米线我们已初步设计了集成微流控芯片装置用于电化学合成导电聚合物纳米线. 该装置把微流控管道与微电极阵列有机组装在一起. 图7A显示了

25、该装置部分示意图. 该装置由微管道及电化学池组成. 这微通道由两部分组成, 一是样品流入通道(主通道);一是控制通道, 它有几个阀门, 用于控制主通道流速. 电化学系统由电化学池及三电极系统组成(微电极阵列为工作电极, 铂片为对电极, 银/氯化银线为参比电极,它位于工作电极附近). 将有机导电聚合物的单体溶流入管道, 并在某一微电极上施加氧化电位. 由于电化学技术能控制电极表面聚合物的结晶及晶核的生长,因而能制备电聚合物纳米线. 图7B显示了该方法在电极表面合成的制备的大量的聚吡咯纳米线. 由该图可见聚吡咯纳米线的直径约50纳米左右, 聚吡咯纳米线也非常均匀, 并且纳米线的长度可达几个微米.

26、A图 7 (A) 集成微流控芯片用于聚吡咯纳米粒合成部分平面示图像. (B). 通过流体力学聚焦法在微流控芯片管道中合成的聚吡咯纳米线的SEM图像.4. 微流控芯片蛋白质荧光标记与细胞分析我们设计并制备了一种微流控芯片用于蛋白质荧光标记并用这种蛋白质标记物来识别细胞极其活性(见图8A).该芯片由合成反应室, 四个细胞固定室组成. 它能依序完成标记, 细胞固定已及细胞成像. 在合成室里有三个阀门, 它们不断地依次打开和关闭, 造成反应物溶液在管道中流动并混合. 红色标识为控制管道, 浅绿色标识为样品溶液流入管道. 我们选用蛋白质为Epidermal Growth Factor (EGF), 它们

27、能识别在细胞表面含有EFG接受器的细胞. 选用荧光物ALEXA标记EGF. 首先ALEXA与EGF在合成室反应, 然后将选用的细胞分别在固定在下面的四个室里; 打开控制管道, 让标记了ALEXA的蛋白质EGF分别流入细胞固定室并反应一段时间. 用缓冲溶液冲洗细胞室. 然后这个芯片可在荧光显微镜下成像. 图8B显示了两种细胞的荧光图像和白光图像. 从该图8B可以看出A431细胞表面有EGF接受器, 而3T3细胞则没有. 这个实验结果证明我们制备的微流控芯片能提供一个平台, 在这个平台上能完成多步功能和反应包括样品标记, 细胞固定与在线, 即时分析.图 8 (A) 芯片结构图. 红色标识为控制管道

28、, 浅绿色标识为样品溶液流入管道.(B)与荧光标记的蛋白质作用后,两种细胞的白光显微成像(上部)与荧光显微成像(下部).研究计划本项目计划用三年时间完成.2007, 1-2007, 12. 设计, 制备 各种微流控芯片并用于各种纳米颗粒的合成, 表征.合成条件的优化与芯片设计的优化. 微管道纳米颗粒形成机制研究. 2008, 1-2008, 12. 具有多功能的集成微流控芯片设计,制备与纳米颗粒合成, 修饰与功能化, 样品标记 与分析应用.纳米颗粒标记用于DNA分析, 蛋白质分析; 功能化纳米颗粒用于环境样品富集与分析.2009, 1-2009, 12.集成微流控芯片设计, 制备 与生物分析与

29、环境分析应用.本课题计划在三年内发表10-15篇高质量论文, 并望有芯片产品能用于实际样品分析.参考文献1.Oosterbroek, R. E.; van den Berg, A., Lab-on-a-Chip: Maniaturized Systems for Bio(Chemical) Analysis and Synthesis. Elsevier Science: Amsterdam, 2003.2.Nguyen, U.-T.; Wereley, S., Fundermetal and Applications of Microfluidics. Artech House: Bosto

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