2×CTAB法植物总DNA提取.doc

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1、2CTAB法植物总DNA提取1. 液氮研磨1g左右的植物组织，转移到离心管中。改用研磨枪在冰上研磨，不加-巯基乙醇研磨时可加入适量的PVP、-巯基乙醇。若CTAB准备2-3天内用完，则可将PVP、-巯基乙醇直接加入其中。2. 加入500l的2*CTAB (60或65预热) ,颠倒混合均匀后在60或65水浴30m-1h小时,其间要上下颠倒混匀数次。3.取出离心管，加入等体积的24：1（三氯甲烷：异戊醇），上下颠倒充分混合。 若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。4.12000转速离心5-10min。将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上。 a.离心后溶液分三层：上层为水相；中层为碎片

2、和蛋白相；底层为氯仿 b.迅速进入下一步，以免各相混合5.用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层。a.此步骤要宁舍不贪多，尽量避免吸取到下层液体。b.若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：1，再次抽提一次，直至中间层较薄。6. 在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20沉淀。沉淀至少15分钟至过夜。6-1 在抽提出的水相中加入1/10体积醋酸钠（pH5.2, 3M），混匀后，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20沉淀15min至过夜。6-3. 在抽提出的水相中加入加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20沉淀15分钟至过夜。

3、a.时间越长，DNA的产量越多，污染也越多7. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，加入700l 70%的酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀。12000转离心5-10m，去上清，倒置于吸水纸上数分钟。重复一遍。8. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，最后置于超净工作台中吹干。9. 在离心管中加入30-50l的灭菌去离子水或者TE溶液，4放置数小时，使其充分溶解。10.用琼脂糖凝胶检测结果。11. -20 -70低温保存。去除总DNA中的 RNA污染 先做预扩增实验，若RNE污染无严重影响则舍去该步骤A 1. 在总DNA溶液中加入灭菌去离子水或

4、者TE溶液调整总体积至200l, 加入10 RNase-A（10mg/ml）4过夜，或者37 1h . 2. 用等体积的24：1抽提。3. 沉淀DNA洗涤DNA干燥DNA溶解DNA -20 -70低温保存。B 直接加入10 RNase-A（10mg/ml）后冷冻保存。试剂配方1M Tris-HCl ( pH7.4, 7.6, 8.0 ) pH 浓HClTris去离子水7.4约70ml121.1g定容至1升7.6约60ml121.1g定容至1升8.0约42ml121.1g定容至1升高温高压灭菌后，室温保存注意：应该在溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度

5、每升高1，溶液的pH大约降低0.03个单位5TBE缓冲液Tris硼酸0.5M EDTA （pH8.0）去离子水54g27.5g20ml定容至1L室温保存50TAE缓冲液Tris冰乙酸0.5M EDTA （pH8.0）去离子水242g57.1ml100ml定容至1L室温保存2CTAB 成分终浓度已有溶液浓度配100ml所加量CTAB2% 2 gTris-HCl（pH8.0）100mM 1M10 mlEDTA20 mM 0.5M4 mlNaCl1.4M 5M28 ml0.5M EDTA （pH8.0）二水乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA2H2ONaOH去离子水186.1g约20克定容至1L高温高压灭

6、菌，室温保存。注：只有pH值接近8.0时，EDTA才能完全溶解。溶解过程可在磁力搅拌器上剧烈搅拌。耗材准备：需要灭菌者： 1.5ml离心管、研磨枪头、蓝色枪头、黄色枪头、其他：卫生纸（吸水用）、镊子、封口膜、挑菌针、酒精灯、70%酒精、离心管架子、离心管盒子、移液枪。CTAB法提取植物基因组药品：2*CTAB终浓度 组分 药品用量 0.1M/L 1M Tris-HCl(pH8.0) 100ml20nM/L 0.5M EDTA(pH8.0) 40 mlNaCl 82gCTAB 20gPVP40 20g加去离子水800ml 充分溶解定容到1L。120 1.5个大气压，灭菌20分钟用之前加0.2-1

7、%的0.5M EDTA(pH8.0)配制量： 1L 配制方法：1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌。 3. 用NaOH调节pH值值8.0（约20g NaOH）。 注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。 4. 加去离子水将溶液定容至1L。 5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。 6. 室温保存1M Tris-HCl(pH8.0)氯仿 ：异戊醇 24:1 异丙醇流程1、 研钵预冷，叶片放入研钵，加液氮，研磨成粉末，用小勺放入2.0mlEP管。2、 加入65预热的2*CTAB 600ul,摇匀;3、

8、65水浴1小时，10min摇动一次4、 12000rpm离心10min, 取上清到一新的EP管中。（次步骤视情况可省略）5、 加入200ul 氯仿 ：异戊醇 ( 24:1)。6、 12000rpm离心10min, 取上层水相到一新的EP管中。7、 加入等体积的异丙醇，轻轻上下摇动10次，静置10min。8、 12000rpm离心10min，弃上清9、 加入75%乙醇1.0ml,摇动10、12000rpm离心2min，弃上清11、吸取多余乙醇，室温吹干12、加入50ul的ddH2O,或TE溶解。-20保存CTAB法提取植物基因组DNACTAB法原理CTAB（Cetyl trimethyl amm

9、onium bromide），十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)， CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。CTAB溶液在低于15时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低

10、于15。另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。 主要试剂与溶液的配制：PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）巯基乙醇氯仿异戊醇（241）异丙醇70%乙醇Tris-苯酚RNaseA无水乙醇CTAB 溶液：CTAB20g/LNaCl（58.44）1.4 mol/L（81.816g）EDTA（292.25）10 mmol/L（2.9225g）Tris（121.14）100 mmol/L（12.114g）pH 8.01TE 缓冲液：EDTA（292.25）1 mmol/L（0.29225g）Tris（121.14）10 mmol/L（1.2114g）pH 8.0NaAC溶液：NaAC（82.03）3mo

11、l/L（246.09g）pH 4.0植物总DNA的提取1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转入10mL的离心管中，放入液氮或-80冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差几倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。2、将（200ml）CTAB溶液放于65水浴锅中预热。3、加4ml巯基乙醇到预热的200mlCTAB中。4、速加3ml预热的CTAB到装有粉末的10mL离心管中，之后放入65水浴锅中，保温3060min，期间轻摇数次（一般20min左右一次，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔）。5、

12、加入34ml氯仿异戊醇（241）（在通风橱中操作），轻摇混匀至乳白色（100200次，剧烈晃动会使DNA机械切割）。6、1520，11000 rpm离心15min（CTAB配平，相对应的离心管，质量相差0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合

13、核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNa

14、se的活性。氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 简言之，无论

15、哪种抽提方法，药品的作用基本都是一样的。CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)发布: 2010-06-02 08:20 | 来源:生物吧 | 编辑:刘浩 | 查看: 634 次原理：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15时会形成沉淀析出，因此，在将其加

16、入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。一、CTAB提取缓冲液的经典配方：Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。二、CTAB提取缓冲液的改进配方：(1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；(2) 蛋白质的去除：酚/氯

17、仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；(3)多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化；(4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG

18、(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合；(5) 盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。三、基因组DNA提取常见问题DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应，DNA中残留有金属离子，有R

19、NA的存留。对策：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)，加入RNase降解RNA。（1）DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。DNA提取常见问题：材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中,避

20、免反复冻融。（2）DNA降解，DNA提取常见问题。实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗涤时DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料，动植物要匀浆研磨充分；G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)。增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。要用冰冻材料提出高质量的基因组DNA，应确保以下几点：1.确保采样后立即投入液氮中保存.2.在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温！否则会DNA降解得很厉害。装管的时候，材料一定要有液氮的

21、保护才行！否则研磨时的液氮保护DNA不都前功尽弃了？可以这样做：将几个离心管放入一个容器，向容器中加液氮，将其冷冻一下，使之处于低温状态，将液氮还为挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。另外，如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。提取DNA时加液氮的目的主要是防止DNA的降解，所以必须一直提醒自己，减少材料回温的机会，液氮保护必须自始至终。3.在用CTAB法提取时，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔！4.加酚/氯仿/异戊醇静置30m

22、in后，离心温度不可过低。尽量保持在15度以上。5.将DNA加入异丙醇析出时用的枪头一定要剪过的。这点很重要。过尖的枪头会把DNA链弄断。6.加入异丙醇后出现的DNA絮状物尽量要挑出，尽量不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的DNA也增多了。另外，看楼主的电泳图条带比较弱，看来不只是降解，提取量也比较少。这里对于增加提取量想说明一点，在研磨样品时，研得细和研得很细，提出的DNA量可以相差几倍！所以，在液氮保护的很好的情况下多研磨几次，要比在后面的过程中离心以增加产量要划得来！主要试剂的配制参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下94：（1）0

23、.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)：称取EDTA-Na2 18.61 g，加80 mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL，在1.03105Pa下高压灭菌20 min。（2）5 mol/L NaCl溶液：称取NaCl 29.22 g，溶解于90 mL的双蒸水，加热到80溶解，冷却，再用双蒸水定容100 mL，在高压灭菌20 min。（3）10 mol/L NaOH溶液：称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水，搅拌，定容到100 mL。（4）1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0)：称取

24、12.114 gTris碱，溶于80 mL的双蒸水，加入浓HC1 4.2 mL，调整PH值到8.0，加水定容到100 mL，高压灭菌20min。（5）10%CTAB（m/v）：称取CTAB 10.00 g，溶解于80 mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100 mL，室温保存。（6）5 mo1/L KAc溶液(pH 4.8和6.5)：分别称取KAc晶体49.07 g，溶于80mL的双蒸水，再用冰乙酸调至pH 4.8和6.5，加双蒸水定容到100 mL，在1.03105Pa下灭菌20 min。4保存。（7）3 mo1/L NaAc3H2O溶液(pH 5.2)：称取NaAc晶体20.412

25、g溶解于约30 mL的双蒸水，用冰乙酸调至pH 5.2，加双蒸水定容到50 mL，高压灭菌20 min。4保存。（8）提取缓冲液（0.4 mol/L葡萄糖，3%PVP，2-巯基乙醇）250 mL：称取葡萄糖19.817 g、PVP 7.50 g，加水溶解并定容到250 mL，在1.03105Pa下灭菌20 min，-巯基乙醇现用现加。4保存。（9）裂解缓冲液（3%CTAB；100 mmo1/L Tris-HC1，pH 8.0；20 mmo1/LEDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；2-巯基乙醇）100 mL： 取10%CTAB 30 mL，加1mol/LTrisHC1(pH 8

26、.0)10 mL，加0.5 mo1/L EDTA(pH8.0)4 mL，加5 mol/LNaCl 28 mL并定容到100 mL，高压灭菌20 min，-巯基乙醇现用现加。（11）TE缓冲液(10 mmo1/LTris-HC1，pH 8.0；1 mmo1/L EDTA，pH 8.0)：取Tris-HCl溶液(pH 8.0)1 mL，EDTA(pH 8.0)0.2 mL，用双蒸水定容到100 mL，高压灭菌20 min。4保存。（12）电泳缓冲液TAE（Tris-乙酸）的配制50TAE母液的配制：242.0 g Tris-Bace、57.1 mL冰乙酸、100 ml 0.5mo1/L EDTA(

27、pH 8.0)，用双蒸水空容至1000 mL。1TAE电泳缓冲液的配制：取50TAE 10 mL，再加入490 mL双蒸水，定容至500mL主要溶液如下：1） 1MTris-HC1（pH 8.0）：在800mL水中溶解121g Tris碱，用浓HC1调节pH至所需值pH 8.0（约42mL HC1），加水定容1000mL，分装后高压灭菌。2） 0.5MEDTA（pH 8.0）：在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTANa22H2O），搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0（约10g NaOH颗粒），定容至500mL，高压灭菌。3） 5 MNaCl：称取292.2 g NaCl

28、，用双蒸水定容到1000mL，高压灭菌备用。4） TE缓冲液（pH 8.0）：10mM Tris-HC1（pH 8.0），1.0mM EDTA（pH 8.0）。5） 2CTAB提取液（pH 8.0）：2（w/v）CTAB，1.4 M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HC1，0.2%巯基乙醇（v/v）。即称取CTAB 2 g，加蒸馏水40mL，加1 M Tris-HCl（pH 8.0）10mL、0.5 M EDTA（pH 8.0）4mL和5 M NaCl 28mL，待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100mL。CTAB提取DNA缓冲液配方CTAB 4g NaCl 16.364 g

29、 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌。 TE缓冲液配方TE的组成浓度为：10mM Tris-HCl ；1mM EDTA PH=8.0，配制过程如下：量取下列溶液于500ml烧杯中 1M Tris-HCl Buffer PH=8. 0 5ml 0.5M EDTA PH=8.0 1ml 向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存. CTAB法提取植物基因组DNA1 实验原理1、 在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在,在制备核酸时，通

30、过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。2、在浓氯化钠溶液(12molL)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14molL)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。3、 进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白：用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，

31、得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：化学因素，核酸的结构在pH值4.011.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、

32、抑制剂使之失活。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。操作过程最好在低温(0左右)下进行。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB分离缓冲液2%CTAB，1.4m

33、ol/LNaCL, 20mmol/LEDTA（PH8.0), 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.2%巯基乙醇100mL： 2gCTAB，8.18g NaCL，0.74gEDTA.Na2.2H2O，加入10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0), 0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。1、 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；3、NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解于液相；4、CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；5、-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚

34、氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除; PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 1、用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。 所以提取RNA时只用氯仿抽提。

35、2、氯仿的作用？ 氯仿：加速有机相与液相分层；去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）3、用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡 (异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定)4、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 1.十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法

36、在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应用的一种。它既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀，因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。1.1原理及方法CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜。同时它能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可解离的，从而可使DNA和多糖物质分开。当溶液盐浓度降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，这些复合物将会从溶液中形成沉淀， 随后通过离心技术就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白类、多糖类物质分开。而对于富含多酚、多糖物质的植物组织，则通过增加提取缓冲液中-巯基乙醇的用量，便可有效地控制酚

37、类物质的氧化褐变及DNA的降解， 用氯仿/异戊醇来沉淀蛋白质，从而提高产物的纯度。最后用乙醇来沉淀DNA，除去CTAB。1.2适用范围及一些改良由于CTAB提取法能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀， 因而适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA。经研究发现CTAB提取法在落羽杉属树木、黑木相思、野生稻、野燕麦、枸杞、花生的DNA的提取中，相比较其他提取方法来说都是最好的提取方法。为了缩短提取流程，提高提取质量，研究人员在传统方法的基础上， 针对不同植物的特点， 对一些提取步骤进行了改进。李先进1在对四种药用蕨类DNA提取的比较研究中发现，由于酚类物质极其容易被氧化， 因此可以在最开始

38、研磨材料的时候加入4%PVP，以防止研磨中细胞组织破裂后酚的氧化，从而获得更为理想的DNA。黄永莲2首先将材料在4放置12天，以便于其叶片中的多糖类物质的降解；然后在用CTAB处理的同时加入蛋白酶K，提高提取缓冲液中-巯基乙醇用量，增加氯仿/异戊醇的量和使用次数，以及缩短异丙醇沉淀DNA的时间。用此改良的CTAB法提取菠菜和榕树叶片DNA，获得了良好的效果。袁燕3对蒜头果基因组进行DNA提纯的研究中发现，EDTA的浓度在2030mmol/L时， 提取DNA的效果较好，同时在提取的过程中，往研钵中加入少量PVP和VitC固体与蒜头果种仁共同研磨， 不仅能阻止多糖、多酚氧化物等与DNA的结合和反应

39、，而且能除去大部分油脂和杂质，可以大大提高DNA的纯度。电泳技术的基本原理介绍电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖凝胶