免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学.docx

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1、免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学免疫组织化学傅琦博引言酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以说明组织细胞的构造和功能为主要内容的科学酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反响的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度断定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联络起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：1利用酶的活性反映的方法；2利用抗原抗体反响免疫应答证明酶的存

2、在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。免疫组织化学概述免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞能否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合构成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反响部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法简称免疫染色法，食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之

3、相应的特异、高效价的抗体；在免疫反响发生之前，目的物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反响，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反响的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反响，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体即第二抗体进行重叠反响，间接的证实抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反响，但敏感度较高，标识抗体的用处也广；补

4、体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，能够用反复进行的重复标记的直接法，可以以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反响，反响结束后，通过免疫化学反响或其他化学反响，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。免疫组织化学技术的发展免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane等人于60年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger等人于70年代初期便在此基

5、础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法)和PAP法(过氧化酶抗过氧化酶法)。80年代初期美籍华人Hsu又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法),自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,Streptavidin)与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP法,或称LSAB法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法)。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反响,故背景染色愈加明晰,且敏感性比ABC法高48倍,比PAP法高816倍。进入90年代,免疫组织化学又向基因水平深化发展,与分子生物学技术的结合日益严密。如原位

6、杂交后信号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因此又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更准确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。1利用免疫荧光标记技术能够分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质,并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体)的含量,以到达对定性、定位、定量测定的目的2。如黄祥瑞等人(1999)利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE),成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒SindbisVirus(SiN)引起的

7、人兽共患虫媒病毒病,1974年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通过免疫荧光技术初次从新疆分离到SiN病毒。1999年陈振光等利用间接免疫荧光试验检测到福建宁化林区人群、野兔、狐狸、狗存在SiN感染,抗体阳性率分别为12.86%、5.88%、14.29%、6.45%。因此断定福建宁化林区可能存在辛德毕斯热自然疫源地。2抗生物素生物素过氧化酶复合物技术(AvidinBiotin2PeroxidaseComplextechnique,简称ABC技术)是Hsu等于1981年创立,其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。该方法简便、节约时间,敏感性、特异性高,背景染

8、色淡。由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力,可用于双重或多重免疫染色。如李月白等采用ABC法研究发现绒毛层滋养细胞、绒毛中轴的基质细胞、毛细血管的内皮细胞、毛细血管腔内的淋巴细胞以及血岛细胞均表现为P物质(SP)受体免疫反响阳性,阳性物质分布于胞质和胞膜上,胞核呈阴性反响。该研究为其对胎盘及胚胎发育的作用提供形态学根据。张雅萍在ABC法基础之上改良,建立了生物素-抗生物素-过氧化物酶复合物(sABC)法,讨论了IL28在甲状腺肿瘤组织中的表达及意义。3葡萄球菌蛋白A(StaphylococalProteinA,SPA或SP)具有免疫特性,发展成为免疫学上一种极为有用的工具。其优点是不

9、受种属特异性的限制,染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等。故在目前各种免疫细胞化学技术中得到广泛的应用。如肖华亮等9用此法检测、讨论骨肉瘤MDM2和p53蛋白定位、表达水平及互相关系和其对骨肉瘤转移及预后的影响。应用SPA与胶体金或铁蛋白相结合,可在电镜水平检查抗原抗体反响的定位。自Pomano和Romano(1977)初次报告用蛋白A-胶体金技术(ProteinA2Goldtechnique,PGA技术)标记细胞外表抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以来,SP法已得到愈来愈广泛的应用,并发展成为一种较为理想的免疫电镜技术。4碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶方法(简称APAA

10、P法)克制了辣根过氧化酶(HRP)的缺乏。沈岩等用APAAP法结合单克隆抗体(mAb)KL21(广谱抗人细胞角蛋白,德国)比拟分析不同肿瘤细胞间同种细胞凝集力、靶器官定植力、细胞增殖和细胞凋亡现象、癌基因及肿瘤相关抗原表达等生物学特征。进一步明确肿瘤细胞相关生物学特性与肿瘤细胞转移能力间的关系。而链霉素亲和素(Streptavidin,SA)具有高度的亲和力,利用生物素结合的二抗与酶标记的SA亲和(LSAB法)是免疫组化中非常有用的方法。沈靖南等采用该法,检测84例骨肉瘤中p2糖蛋白(p2gp)表达,半定量化计量p2gp的着色强度及阳性率,通太多因素相关分析和生存分析,讨论骨肉瘤预后的相关因素

11、和高危因素,研究骨肉瘤多药耐药性的表达与预后,并证明p2gp介导骨肉瘤的MDR现象,明确p2gp表达与肺转移的关系。5凝集素(Phytoagglutin,PHA)作为一种探针研究细胞膜上特定的糖基,具有多价结合能力。直接将标记物标记在凝集素上,再与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合,该法简便,但灵敏性不够高。经研究发现将凝集素直接与切片中的相应糖基结合,可提高敏感性高510倍或更多一些,有人以为若将凝集素与特定的糖基作成三明治样的糖2凝集素2糖的结合物,特异性、灵敏度将会更高。而且能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合,进而在光镜与?或电镜水平显示其结合部位。Newman等(1979)

12、以荧光素标记凝集素PHA实验,发如今大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。Kivela和Farkkanen(1987)用凝集素作为细胞特殊类型的标记实验发现,在人视网膜上PHA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PHA阳性反响,而肌上皮细胞和间质细胞呈PHA阴性反响。他以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明,刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏的各部,PHA和双花扁豆凝集素(DBA)主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞,荆豆凝集素(UEA)主要分布在血管内皮细胞,而麦芽素分布在肾小球。Streit和Kreutzberg(1987)发现GriffoniaSimpl

13、icifolia凝集素能特异性标记面神经节内的小胶质细胞,而其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞(Astro2cyte)等都显示阴性反响。假如在切断面神经后,增殖的小胶质细胞对GriffoniaSimplicifolia凝集素的反响加强。大量研究发现,凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等(1987)报道115例胃癌标记PHA阳性率高达90.43%,而正常胃粘膜基本是阴性,故以为PHA是胃癌的诊断性标志。BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79%,而对良性病变均呈阴性反响,提示BSA可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。HRP本身虽含有甘露糖,能与刀豆

14、凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。但对其它的凝集素,需要将糖基化(Glycosylation)过氧化物酶结合到该凝集素上,且糖基化过氧化物酶品种尚有限,故目前本法在应用还有一定困难。免疫细胞化学技术尚在继续改良和完善中,除目前国内外已广泛应用的免疫金技术和免疫金银技术外,新的免疫细胞化学技术不断出现。1984年国外学者初次将CRNA探针应用于原位杂交,核酸探针为单链的RNA分子,产生自具有质粒逆转录系统的cDNA克隆。在1987年Wolf等建议插入确定长度的寡核苷酸至载体内产生cRNA分子,这种cRNA分子称为“寡核苷酸核酸探针(oligoriboprobes),如今已被广泛的用于原位杂交

15、实验。国内的杨春花等采用免疫组化和cDNA2mRNA原位分子杂交技术分别检测了24例RA,18例骨关节炎(OA)和6例正常滑膜组织中uPA,uPAR蛋白和mRNA的分布及表达情况。科研工作者根据免疫组织化学中材料的特性把同位素、生物素、光敏生物素、酶促生物素、地高辛标记cRNA上成功的制成探针。尤其地高辛与放射性标记相比,标记探针具有非放射性探针的优点,对人体无害,不受半衰期限制,探针可长期保存;与生物素标记探针相比,不受组织、细胞中内源性生物素的干扰,敏感性、分辨率较高,反响产物颜色鲜艳,反差好,背景染色低,制备探针可较长期保存,对人体无害等优点,已日益显示出它的优越性和广泛的应用前景。并且

16、进一步研究发现它能根据需要人工用DNA合成仪合成,其长度及分子大小比拟一致,可控地高辛同位素寡核苷酸探针。另外,放射性同位素、荧光素、生物素也能成功标记寡核苷酸作为探针,成功地运用于培养细胞、组织切片和染色体铺片等的原位杂交中。固然有些人以为其敏感度不如来自质粒扩增的cRNA或DNA探针,但由于探针制备简便再加之于近年非放射性标记的成功,寡核苷酸探针在生物基础医学及临床学科领域中得到较为广泛的应用。免疫细胞化学技术与流式细胞术(FCM)结合进行多参数FCM分析血液淋巴细胞免疫表型(亚群)方法学因素对实验结果的影响。当血液收集后1h和6h测定淋巴细胞免疫表型结果差异无显著。如黄勇华等采用单标或双

17、标直接免疫荧光标记法标记20种细胞外表分化抗原,经流式细胞仪测定。后进行分析185例白血病患者骨髓或外周血白血病细胞的免疫分型及CD117的表达细胞外表分化抗原(CD)117在各型白血病中的表达及其意义。免疫细胞化学技术先进仪器和方法结合已呈现新的趋势，如用荧光显微分光光度计和图像分析仪等定量检测,将结果客观打印、报告,这更合适于临床诊断和科学研究。如杨希谦等采用非放射碘标记人直肠癌相关抗原单克隆抗体(McAb)技术与生物导向CT显像进行肿瘤的免疫组化鉴定与免疫显像研究。免疫组织化学技术在临床病理诊断中的重要作用100年前发明的用光学显微镜观察HE染色切片法仍然是当前各级医院病理科中的基本方法

18、。该方法的局限性在于仅能从细胞水平反映疾病性质,诊断中观察者的主观揣测成份高,经常是同一疾病出现分歧颇大的数个不同诊断,多年来成为临床病理诊断中的突出问题。而免疫组织化学方法是通过抗原抗体反响客观地反映疾病性质,在观察HE切片基础上,再结合免疫组织化学染色结果可对某一疾病做出较为客观公正的评价,进而可避免主观因素的影响。自免疫组织化学技术应用于临床病理诊断以来,在下面几类疾病的鉴别诊断中发挥着重要作用。1高度未分化肿瘤细胞起源的鉴别:发生在胃肠道的这类肿瘤应首选CEA与Vimentin两种抗体鉴别是上皮源性抑或是间叶源性肿瘤。由于CEA在消化道上皮源性肿瘤的阳性率高,但在鳞癌时阳性率低;而消化

19、道以外部位发生者,上皮性标记物宜选用EMA,该抗体在90%以上上皮源性肿瘤呈阳性表达。2小圆细胞肿瘤的鉴别:小圆细胞肿瘤包括小细胞未分化癌、恶性淋巴瘤、小细胞软组织肉瘤、神经内分泌肿瘤以及小细胞黑色素瘤。这类肿瘤鉴别诊断时应使用EMA或CEA,LCA,Vimentin,NSE,S100和HMB45抗体。3大细胞型肿瘤鉴别:这类肿瘤能够是大细胞未分化癌、低分化肉瘤、大细胞性黑色素瘤和大细胞性恶性淋巴瘤。在鉴别诊断时应该选用EMA或CEA,Vimentin,S100和LCA抗体。4梭形或多形性软组织肉瘤的鉴别:此类肿瘤包括平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、梭形细胞血管肉瘤、梭形细胞黑色素瘤、多形性横纹肌肉瘤、

20、多形性恶性纤维组织细胞瘤以及多形性脂肪肉瘤。下面抗体可用于鉴别诊断:Actin,EMA,FAg,S100,MB45,Myoglobin,Desmin,12AT以及12ACT。5恶性淋巴瘤分型:在免疫组织化学研究领域，当前对恶性淋巴瘤的免疫组织化学研究最为活跃与细致。截止目前为止,已有下列亚型能够通过免疫组织化学染色确立。它们是:B细胞淋巴瘤,L26阳性,LN2阳性;T细胞淋巴瘤,MT1阳性,UCHL1阳性;NK细胞淋巴瘤C123C阳性;树突网织细胞淋巴瘤,Ber2MAC2DRC阳性;指状突网织细胞淋巴瘤,S100阳性;真性组织细胞淋巴瘤,Mac387阳性,Lysozyme阳性,12ACT阳性;

21、何杰金病R2S细胞,LeuM1阳性,Ber2H2阳性;大细胞间变型淋巴瘤Ber2H2(或称Ki21)阳性。6神经内分泌肿瘤确实立:90%以上的神经内分泌肿瘤NSE阳性。由于NSE与其它肿瘤有穿插反响,故必要时可加染ChromograninA或Synaptophysin抗体。当需要弄清神经内分泌肿瘤有否内分泌功能时,再加染多肽类激素抗体。7肿瘤预后的揣测:最早用于揣测肿瘤预后的抗体有抗雌激素受体ER及抗孕激素受体PR,二者阳性时预后较好。新近又发现,转移抑制基因产物nm23呈高表达时预后较好。而下列几种抗体呈高表达时均提示预后差：C2erbB22,C2myc,P53,EGFR,PCNA,Ki26

22、7,BrdU,P120,P105。8感染性疾病病原体的检测:其中HBsAg及HBcAg抗体常用于肝病研究与诊断。而尖锐湿疣及宫颈癌时经常能够检测到乳头状瘤病毒HPV。鼻咽癌、何杰金病时EB病毒抗体多呈阳性。免疫组织化学技术由于它本身独有的特点,使得广大科研作者在组织细胞定位、定性、定量研究中经常选取的技术,因而随着科研工具的更新,科研工作者对免疫组织化学更广泛深化的理解、并与其他研究手段深化结合,优化技术道路地设计,而推动免疫组织化学技术的进一步发展。如范少地等运用GAP243cDNA探针(生长相关蛋白243(Growthassociatedpro2tein43,GAP243)原位杂交技术来观

23、察这一变化经过中GAP243mRNA表达水平,阳性细胞定位及分布的变化。李月白等应用免疫组化LSAB法和原位杂交方法,观察了骨肉瘤患者p21waf1?cip1表达水平与临床预后之间的关系。而倪灿荣等应用他们实验室制备的催化信号放大(Catalyzedsignalamplifi2cation,CSA)试剂应用于IHC检测50例10种不同类型的肿瘤切片中40种不同的抗原和ISH检测6种不同的RNA成分,并与常规方法进行敏感性比拟:CSA2IHC法较传统的PAP法、ABC法和LSAB法敏感5001000倍,较EnVision法敏感20100倍。参考文献1巴德年现代免疫学技术与应用北京医科大学中国协和

24、医科大学联合出版社,1999.1-11.2沈关心,周汝麟当代免疫学实验技术湖北科学出版社,1998.1-50.3黄翔瑞,陈娟,李晓萸等西藏环状病毒细胞生物学特性研究军事医学科学院院刊,2000,24(3):173-176.4PritchardLI,GouldAR.Phylogeneticcomparisonoftheserotype2specificVP2proteinofbluetongueandrelatedorbivirusesJ.VirusRes,1995,39(2-3):207-210.5梁国栋,李其平,何英等我国初次分离到辛德毕斯病毒病毒学报1993,5(1):55-576陈振光,

25、陈娟,黄翔瑞等福建宁化辛德毕斯热血清学调查中国媒介生物学及控制杂志,2000,11(2):137-139.7李月白,秦国斌,王义生等人骨肉瘤中p21waf1/cip1基因的表达中华骨科杂志,2000,20(1):30-33.8张雅萍,姬秋和,张南雁等甲状腺肿瘤组织中IL28的表达及意义第四军医大学学报,2000,21(6):125-128.9肖华亮,陈俐,王东MDM2蛋白和P53蛋白在骨肉瘤组织中的表达及意义第三军医大学学报,2000,22(4):357-359.10沈岩,VogelIKalthoffH,于吉人,等.不同转移能力肿瘤细胞间转移相关特征的比拟研究J.中华肿瘤杂志,2000,22(

26、3):201-204.11沈靖南,王晋,韩士英等骨肉瘤p2糖蛋白表达水平与肺转移中华骨科杂志,2000,20(1):21-23.12蔡文琴,王伯倪实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术成都:四川科学技术出版社,1994.1-20.13NewmanRA.Bindingofpeanutlectintobreastepithe2lium,humancarcinomaandculturedratmammarystemcells:Useofthelectinasamarberofmammarydifferen2tiationJ.JNatlCancerInst,1979,63:1339-1342.14Kive

27、rlaTandTarkanenA.AlectincytochemicalstudyofglycoconjugatesinthehumanretinaJ.CellTissueRes,1987,249:277-280.15StreitWJandKreutzbergGW.lectinbindingbyrestingandreactivemicrogliaJ.Neurocytology,1987,16:249-251.16张华忠.凝集素在人体正常组织的定位中华医学杂志,1985,65:144-147.17金冬雁,李孟枫,译.分子克隆实验指南北京科学出版社,1992:495-569.18杨春花,黄烽类风

28、湿关节炎中尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体蛋白和基因的表达当代妇产科进展,2000,9(5):5-7.19黄勇华,MargarettaBjoeling脑出血患者血肿周围星形细胞内皮素21表达免疫组化研究军医进修学院学报,2000,21(1):5-8.20杨希谦,李建远,刘奉立等碘标记直肠癌相关抗原单克隆抗体的免疫显像研究中国肛肠病杂志,2000,20(4):4-7.21范少地缓慢牵伸肢体延长时周围神经损害及修复经过中生长相关蛋白243mRNA表达的实验研究第三军医大学学报,2000,22(2):470-473.22倪灿荣,郑建明,朱明华等催化信号放大系统的制备及其在免疫组化和原位杂交中的应用J.

29、第二军医大学学报,2000,21(4):336-340.23黄晓赤，罗克枢免疫组织化学技术的临床应用大概情况成都医药2003年10月第29卷第5期24李再新，孙素荣，张富春免疫组织化学技术进展及在医学研究中的应用地方病通报2002年第17卷第3期25刘复生免疫组织化学癌症进展杂志2004年5月第二卷第3期26蔡太生免疫组织化学技术DIGESTOFTHEWORLDLASTESTMEDICALINFORMATIONDecember2004.Vol.3.No.627于颖彦免疫组织化学研究新进展河北医科大学学报1999年5月第20卷第3期28蔡豪杰有关免疫组织化学技术方法若干问题的讨论中国组织化学与细胞化学杂志1998年9月第7卷第3期