临床检验基础实验指导_2.docx

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1、临床检验基础实验指导临床检验基础学实验指导血液常规检验一、微量吸管的使用、毛细血管采血、计数板的鉴定与使用【实验目的】：把握微量吸管的使用、毛细血管采血、计数板的鉴定、构造与使用。【实验试剂】：红细胞稀释液、75%乙醇、消毒药棉。【实验器材】：一次性采血针、计数板、盖玻片、微量吸管、2ml吸管、中号试管、显微镜、小玻璃棒。【实验原理】：一次性采血针刺破毛细血管后，用微量吸管汲取一定量的血液，稀释一定的倍数，冲入计数池计数一定体积内的细胞的数量。【实验方法】：一、微量吸管的使用：用抗凝血训练微量吸管的使用。二、毛细血管采血以红细胞计数为例：准备：取清洁枯燥试管一支，加2ml红细胞稀释液。采血部位

2、选择、推拿-75%乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒一待酒精挥发干否则血流不成滴-自指尖腹内侧迅速刺针一擦去第一滴血一准确汲取10ul血液-用无菌干棉球压住伤口止血-用无菌干棉球擦去管尖外围余血后-将血液释放到稀释液底部-回吸上清液2-3次-轻轻混匀。三、计数板构造与应用1.计数板构造外观构造：每块计数板由“H型凹槽分上下两个计数室，在计数室两侧各有一条支柱，比计数室高出0.1mm将一块平整光滑的血细胞计数专用盖玻片24.0mnrK20.0mmK0.6mm覆盖其上时，盖玻片与计数室间构成0.1mm的缝隙。格子构造：计数池长、宽各3mm平均分成9个大格，每个大方格的容积是0.1mm3四角的四个大方格分

3、别用单线划分成16个中方格，是白细胞计数区域；中央的大方格用双线条划分成25个中方格，每个中方格又用单线划分成16个小方格，其中四角和正中的5个中方格是红细胞计数区域。2.计数板的使用：用清洁枯燥柔软的纱布擦拭计数板及盖玻片一用推盖法从计数板下缘向前平推盖玻片将其盖在计数室上一充分混匀细胞悬液一充池一静置一观察细胞分布情况若严重不匀，应重新充池。【注意事项】：1.采血部位应选择皮肤完好，不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。2.针刺应迅速，深度适宜约2-3mm。待血液自行流出，擦去第滴血。3.微量吸管取血时应将微量吸管管尖侧着插入血滴中央。若血流不暢，能够左手自采血部位远端向指尖稍压力至血液流出

4、为止。切忌用力挤压，造成组织液混入，影响结果准确性。4.计数板在使用中勿让手指接触计数池及盖玻片外表，以访油腻污染，致使充液时起泡。二、血涂片的制作，瑞氏染色【实验目的】：把握血片制作方法，瑞氏染色原理及方法。【实验试剂】：瑞吉氏复合染液I液、U液【实验器材】：显微镜、载玻片、推玻片、一次性针头、消毒棉球、洗耳球【实验原理】：细胞的着色既有化学的亲和作用，又有物理的吸附作用，不同的细胞由于其所含化学成分不一样，化学性质各不一样，所以对染料的亲和力也不一样，因而将细胞染成不同的颜色。【实验方法】：一、瑞一吉氏复合染液配制I液：取瑞特染粉1g,吉姆萨染粉0.3g，置干净研钵中，加少量甲醇分析纯，研

5、磨片刻，吸出上层染液，再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上层染液。如此连续几次，共用甲醇500ml。采集于棕色瓶中，天天早晚各振摇3共5天，再存放一周，将染液过滤后即可使用。U液：磷酸盐缓冲液PH6.56.8，取磷酸二氧钾无水6.64g，磷酸氟二钠无水2.56g，加少量蒸馏水溶解，调整PH后，加水至1000ml二、血片制作、瑞氏染色方法准备：取清洁枯燥载玻片，边缘光滑清洁推玻片各一张。1、制备血涂片：取载玻片一取血1滴于载玻片右端边缘留1.5cm空隙一左手持载玻片，右手持推玻片-将推玻片放至血滴前沿逐步后移至血滴沿推片散开后，推玻片与载玻片成30?35的夹角以平稳的速度将血液向前推进枯燥手持载玻片

6、末端迅速在空气中挥动枯燥。2、染色：将干透的血涂片放在水平位置一加瑞吉氏复合染液I液数滴，以染液覆盖整个血膜为度静置染0.5?1min-滴加约2倍于I液量的U液用洗耳球吹气混匀染色5-10min-平持玻片用流线型水洗枯燥镜检【注意事项】：1?严格皮肤消毒。2.血滴大、血黏度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。3.染料放置时间越长，美兰逐步氧化为天青，染色效果越好。4?染液淡，室温低，细胞多则染色时间长，反之减少染色时间。5?水洗方法为平持血涂片流线型水缓缓冲洗干净，不要先倒掉染液。三、白细胞计数WBC【实验目的】：把握白细胞计数的原理、操作方法与结果报告。【实验原理】：用白细胞稀释液

7、将全血稀释一定的倍数并毁坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积的白细胞数，经换算求出每升血液中的白细胞数量。【实验试剂】：白细胞稀释液【实验器材】：显微镜、改进Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒【实验方法】：准备：取清洁枯燥试管一支，加0.38ml白细胞稀释液。采血部位推拿-75%乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒一待酒精挥发干否则血流不成滴一自指尖腹内侧迅速刺针一擦去第一滴血一准确汲取20ul血液用无菌干棉球压住伤口止血用无菌干棉球擦去管尖外围余血后将血液轻轻释放到稀释液底部回吸上清液2-3次混匀室温静置至液体变为棕褐色即红细胞毁坏完全清洁计数板、盖玻片充池静置23min待细

8、胞下沉低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数计算报告。计算：WBO四个大方格内的白细胞数N/4X10X20X106=N/20X109/L【注意事项】：1.采血部位应选择皮肤完好，不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。2?针刺应迅速，深度适宜约23mm。待血液自行流出，擦去第滴血。3.稀释液要过滤使用，试管、计数板均须清洁，以免混入杂质被误以为白细胞。4.加稀释液、血液量应准确，以保证稀释倍数。5.计数池内细胞分布要均匀，每个大方格间白细胞数差异不得超过均值的土10%，否则要重新充液计数。6.严格把握计数原则，以免人为扩大或缩小计数区域。7.白细胞数量过高时，可加大稀释倍数，反之白细胞过低时可计数8

9、个大方格内白细胞数或加大取血量。四、白细胞分类计数DC【实验目的】：把握显微镜法外周血分类计数的方法、各种白细胞的镜下形态。【实验原理】：将血液制备成涂片，经瑞吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占百分比。【实验试剂】：瑞吉氏复合染液【实验器材】：显微镜、外周血标本片、香柏油、擦镜纸、清洁剂【实验方法】：准备：血涂片制备及瑞吉氏染色待干低倍镜下选择细胞分布均匀、着色良好的区域一转油镜按一定的规律移动视野，依次进行分类计够100个白细胞一算出各种白细胞的百分比一报告【注意事项】：1.涂片制备要厚薄适中、均匀、头体尾分明。2.分类时要有程

10、序地连续进行，避免主观选择视野。3.分类中如见幼红细胞，不计入100个白细胞内，以分类100个白细胞经过中见到幼红细胞多少个来报告，并应注明其所属阶段，4.分类中应注意观察成熟红细胞、血小板的形态染色及其分布情况，注意有无寄生虫如疟原虫及其他异常所见。五、白细胞计数WBC及分类计数DC【实验目的】：把握白细胞计数及分类计数原理、方法与结果报告【实验原理】：白细胞计数原理：用白细胞稀释液将全血稀释一定的倍数并毁坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积的白细胞数，经换算求出每升血液中的白细胞数量。白细胞分类计数原理：将血液制备成涂片，经瑞吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。

11、通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占百分比。【实验试剂】：白细胞稀释液、瑞吉氏复合染液【实验器材】：显微镜、改进Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒、载玻片、推玻片、香柏油、擦镜纸、清洁剂【实验方法】：准备：1.取清洁枯燥试管一支，加0.38ml白细胞稀释液。2.取清洁枯燥载玻片，边缘光滑清洁推玻片各一张。采血部位推拿-75%乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒一待酒精挥发干否则血流不成滴一自指尖腹内侧迅速刺针一擦去第一滴血一准确汲取20ul血液用无菌干棉球擦去管尖外围余血后将血液轻轻释放到稀释液底部-回吸上清液2-3次-混匀-另取血一滴于载玻片的右端-立即推制血膜-用无菌干棉球压

12、住伤口止血-清洁计数板、盖玻片-充池静置23min待细胞下沉-低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数-将干透的血膜进行瑞吉氏染色-油镜下分类计数-计算-报告。六、红细胞计数RBC、Hb测定【实验目的】：把握红细胞计数，Hb测定原理、操作方法，规范的报告结果【实验原理】：红细胞计数原理：用等滲稀释液将血液稀释一滴倍数，充入计数池，在显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经换算求得内升血液中的红细胞数。Hb测定HiCN法原理：血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，后者再与氰离子结合构成稳定地氰化搞铁血红蛋白HiCN,HiCN在规定波长540nm和液层厚度1cm的条件下具有一定的毫摩尔消光系数。可用标准

13、的高精度分光光度计进行直接定量测定，或用HiCN标准液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。【实验试剂】：红细胞稀释液甲醛枸木缘酸盐稀释液，HiCN转化液【实验器材】：改进Neubauer计数板、显微镜、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、玻璃棒、【实验方法】：RBC:取清洁枯燥试管一支一加红细胞稀释液1.99ml一加未梢血10ul于稀释液底部一汲取上清液嗽洗34次一颠倒混匀一清洁计数板，盖玻片一充液一静置23一计数中央大格中四角及正中5个方各细胞数f计算612RBC=5个中方格细胞数X5X10X200X10=5个中方格细胞数X10/L。Hb测定：1.直接定量测定法：取中号试管一支

14、一加HiCN转化液5mlf加未梢血20ul一混匀静置5f721比色，波长540nm以转化液为空白对照管一测其吸光度“Af计算“AX367.7-报告2.标准曲线法：将血红蛋白标准液稀释成不同的三种浓度150g/L、100g/L、50g/L分别测其吸光度“A，以“A为纵坐标，血红蛋白标准液参考值g/L为横坐标，绘制标准曲线。通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度。【注意事项】：1.取血应顺利、准确，采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症，不得过渡挤压，红细胞数量明显增高者可适当加大稀释倍数。2.HiCN转化液应置棕色瓶于4C冰箱中，不能储存于白色瓶、塑料瓶及强光下，否则会使CN丢失，结果偏低。

15、3.HiCN转化液中有氧化钾剧毒，防止污染。测定后的比色液不能与酸性溶液混合，否则可产生剧毒的氢氰酸气体。4.所用分光光度计的波长、吸光度需要校正，带宽应小于1nm比色杯光径1.000cm时，测定温度为20C?25C。七、血液常规检验【实验目的】：把握血常规的连续操作规程并规范的报告结果。【实验原理】：见实验二、三、四、六【实验试剂】：红细胞稀释液、白细胞稀释液、瑞吉氏复合染液、HiCN转化液【实验器材】：改进Neubauer计数板、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、显微镜、玻棒。【实验方法】：取大、中、小号试管各一支一分别加HiCN转化液5ml、红细胞稀释液2ml、白细胞稀释液0.38ml-手指消毒针刺-分别取未梢血10ul于红细胞稀释液中、20ul于白细胞稀释液中、20ul于HiCN转化液中-并及时混匀-取清洁枯燥玻片粘取1滴血液于玻片一端-推制血片-待干-721比色-瑞氏染色-白细胞及红细胞计数-DC-计算-报告血常规结果报告正常值：成人儿童新生儿成年男性成年女性儿童