赭曲霉毒素A的毒性研究进展_1.docx

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1、赭曲霉毒素A的毒性研究进展赭曲霉毒素A的毒性研究进展高翔1,李梅2综述张立实1审校摘要：赭曲霉毒素A(OTA)是一种分布较广的真菌毒素。研究表明OTA具有较强的肝毒性和肾毒性,并有致畸、致突变和致癌作用。OTA也被以为可能是巴尔干地方肾病的主要致病因素之一。OTA与人类健康的关系越来越遭到全球重视,国外对OTA的毒性已进行了多方面的研究,而国内研究较少。本文就OTA的毒性及可能的作用机制方面的最新研究进行综述。赭曲霉毒素(ochratoxin)是曲霉菌属和青霉菌属的某些种产生的二级代谢产物,包含7种构造类似的化合物。赭曲霉毒素对农作物的污染在全球范围内都比拟严重,其中赭曲霉毒素A(ochrat

2、oxinA,OTA)在自然界分布最广泛,毒性最强,对人类和动植物影响最大。研究表明OTA不仅具有免疫毒性、肾毒性和肝毒性,并且还有致畸、致突变和致癌作用1。本文就OTA的毒性研究进展及可能的作用机制等方面进行综述。1主要产毒菌种自然界中产生OTA的真菌种类繁多,但以纯绿青霉、赭曲霉和碳黑曲霉为主。这3种产毒菌株生长繁衍所需的生态环境、污染农作物的种类、污染率等依地域不同而异。在热带和亚热带地区,农作物在田间和储存经过中污染的OTA主要由赭曲霉产生;在加拿大和欧洲等严寒地区,粮食及其制品中的OTA主要来自纯绿青霉;碳黑曲霉以侵染水果为主,是新鲜葡萄、葡萄干、葡萄酒和咖啡中OTA的主要产生菌2。2

3、理化性质及代谢赭曲霉毒素是由异香豆素连接到B-苯丙氨酸上的衍生物,其中OTA分子式为C20H18ClNO6,它是一种稳定的无色结晶化合物,溶于极性溶剂和碳酸氢钠溶液,微溶于水。OTA在紫外线照射下呈绿色荧光,最大吸收峰为333nm。关于OTA在动物体内的代谢机制目前还不特别清楚。动物代谢试验发现,OTA能被哺乳动物胃肠道内的羧肽酶A和微生物水解成毒性较低的产物,如赭曲霉毒素A和苯丙氨酸。亦有研究表明OTA主要被动物体内的多功能氧化酶通过羟化作用生成低毒性的4-R-羟化-OTA(OTA-OH)3。OTA代谢的半减期不仅有种属差异而且还有组织器官差异,如OTA在大鼠体内的半减期为103h,在牛体内

4、的半减期为90h,而在小鸡体内的半减期仅为4h4;OTA在大鼠肝脏内的半减期为60h,在肾脏中为54h,在心脏中为48h,在肌肉中为97h,而在血液中为103h。很多研究结果证明OTA与血清蛋白的结合力与其在血液中的半减期长短有直接关系,即OTA与血清蛋白的亲合力大于OTA与组织蛋白的亲合力,故OTA在血液中的半减期较在其他组织中的半减期长5。3毒性由于OTA能够直接污染谷类、水果等农作物,人和动物通过摄入污染的植物性食物而吸收进入体内,同时可以因OTA在动物体内的蓄积作用而通过摄入动物性食物进入人体内。很多研究表明OTA的主要靶器官为肝和肾,用HPLC及ELISA法检测也发现OTA进入小鸡体

5、内后广泛分布于各个器官,但以肝和肾居高6。311肾毒性巴尔干地方性肾病(Balkanendemicne-phropathy,BEN)是一种病因未明的慢性肾脏疾病,主要病理表现为肾小管变形退化、间质纤维化和肾小球的玻璃样变,伴有蛋白尿和肾功能的损伤,但是没有肾病综合征的表现7。OTA被以为可能是BEN的主要致病因素之一,部分研究已经发现食物中OTA含量与BEN临床表现之间的相关性,但亦有研究未发现这种相关性8。对欧洲一些OTA污染较严重的国家和地区人群的血清样品分析发现,健康人群血液中OTA的浓度为012536nmolPL,而地方性肾病、肾盂癌、输尿管癌和膀胱癌患者血液中的OTA浓度则增至514

6、0nmolPL9。短期试验结果显示,OTA对所有的单胃哺乳类动物均有肾毒性,可引起实验动物肾萎缩或肿大、颜色变灰白、皮质外表不平、断面可见皮质纤维性变;显微镜下可见肾小管萎缩、间质纤维化、肾小球透明变性、肾小管坏死等,并伴有尿量减少、血尿素氮升高、对氨基马尿酸去除率降低、尿频、尿蛋白和尿糖增加等肾功能损害的表现2。312肝毒性在每kg饲料中参加0131mgOTA喂饲小鸡后发现其肝糖原分解减少,并且肝内的肝糖原聚集与OTA有剂量-效应关系4。郭延溃等10对OTA中毒鸡的肝脏超微构造观察发现：肝小叶大小不一,小叶间结缔组织增厚,肝细胞的核膜增厚,线粒体肿胀溶解,内质网显著减少。胞浆内出现大量集结的

7、糖原颗粒,还有很多大小不等的异物。肝细胞内出现大量自吞噬泡,次级溶酶体增加,有的肝细胞已被完全溶解。肝窦内星状细胞显著减少,并有大量红细胞,可以看到B淋巴细胞。肝组织中,内皮细胞显著增生,填充于肝窦之中,使肝窦空间变小。肝细胞的微绒毛减少,肝细胞之间的间隙亦变小。313免疫毒性在研究OTA及其代谢物对人单核细胞P巨噬细胞系TPH-1的免疫毒性时发现,当OTA浓度在101000ngPml时,TPH-1的代谢能力、细胞的增殖能力、细胞膜的完好性、细胞的分化、巨噬细胞的吞噬能力、氧化氮的合成及细胞外表标志物的构成均被抑制。而个别细胞系在OTA为1ngPml时就出现了上述现象11。给810周龄的瑞士小

8、鼠天天腹腔注射OTA5mgPkg,连续50天,可抑制受试小鼠体内免疫球蛋白的合成,继而降低细胞介导的免疫应答,同时减少刀豆素A诱导的小鼠脾淋巴干细胞的有丝分裂2。314对肿瘤发生的影响给予80只F344大鼠(雌雄各半)21、70、210LgPkg3种剂量的OTA两年后发现,大鼠出现了肾小管增生性损伤、肾小管细胞腺瘤和肾小管细胞癌,并呈剂量-效应关系。其中高剂量组1只雄鼠在喂饲第9个月时出现肾小管细胞癌,在第15个月时所有雄鼠均出现了肾小管细胞腺瘤和肾小管细胞癌。在试验结束时3个剂量组所有的雌雄大鼠均出现了肾小管细胞肿瘤,尤以雄鼠的反响更为明显,高剂量组的雄鼠中大约有1P3肾小管细胞癌发展为转移

9、性癌12。固然很多研究发现OTA的毒性及致癌性存在种属、性别和年龄的差异,但其机制尚不清楚13。在体外研究中,用OTA染毒人类单核细胞系TPH-14h后发现,在400ngPml剂量组,肿瘤坏死因子(TNF)A的分泌减少了50%14。315致突变作用对用OTA染毒的人源性肝细胞瘤(HepG2)细胞进行微核试验和彗星试验时发现,在5LgPml及更高剂量组毒性作用与染毒剂量之间呈现明显的剂量-效应关系,用25LgPmlOTA处理HepG2细胞后出现明显的DNA损伤(彗星构成),表明OTA对人源性细胞有诱变作用,亦即OTA对人肝组织可能有遗传毒性作用15。用彗星试验检测经OTA染毒处理的马-达氏犬肾(

10、Madin-Darbycaninekidney,MDCK)上皮细胞发现,OTA引起的DNA单链断裂呈剂量-效应关系,参加外源性代谢活化酶系(S9-大鼠肝匀浆)后这种遗传毒性效应更为明显。用氨甲蝶呤、橘霉素等有机阴离子转运系统为底物与OTA混合培养,OTA的毒性作用就会被抑制。假如添加胞嘧啶阿糖胞苷和羟基脲来抑制DNA的修复,尾长即明显增加,所有被处理的细胞都出现DNA的单链断裂16。316对其他器官的毒性在人造血母细胞的体外培养试验中发现,OTA的浓度为100LmolPL时,能引起有核红细胞和单核粒细胞的原代增殖减少和毁坏血小板母细胞。在OTA浓度低时,造血母细胞的增殖未受影响17。此外OTA

11、能减少大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的2A亚基和2B亚基的浓度。而海马趾的NMDA受体与学习和记忆有关,因而以为这种改变可能对认知功能有一定的影响18。用015LgPml或1LgPml浓度的OTA染毒12日龄大鼠胚胎中脑细胞48h后,发现细胞数量减少及神经突生长速度降低,且二者均呈现剂量-效应关系。同样浓度的OTA染毒3h后发现转移因子活化蛋白-1(AP-1)及核因子JB(NF-JB)的活性均降低19。4OTA毒作用可能的作用机制411影响蛋白质的合成研究发现低剂量OTA即可降低实验动物肝脏和肾脏中苯丙氨酸羟化酶的活性。分别给雌性大鼠天天喂饲50LgPkg的OTA10天和35天

12、后苯丙氨酸羟化酶的活性显著降低,尽管OTA在肾脏中的浓度高于在肝脏中的,但是这种抑制作用在肝脏更为明显。同样的抑制作用也出如今体外试验中。OTA和苯丙氨酸联合作用能够减少对苯丙氨酸羟化酶的抑制,十分在肝脏更为明显20。此外还发现OTA能与苯丙氨酸竞争苯丙氨酸-tRNA结合位点进而抑制蛋白质的合成21,22。但亦有研究发如今试验中参加苯丙氨酸并不对OTA引起的细胞毒性有减轻作用23,24,故还需要做进一步的研究,以确定OTA能否对苯丙氨酸在体内的代谢转化有影响。412造成氧化应激损伤很多学者以为氧化应激是OTA毒性的一个重要机制。研究证明,所有的细胞成分,包括核酸、蛋白质及脂类等均可遭到自由基反

13、响的损害。而介入抗氧化作用的酶,包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSPx)、谷胱甘肽复原酶(GR)、过氧化氢酶(CAT)等能消除自由基,防御过氧化损害。Schaaf等25研究发现,OTA能提高原代大鼠肾近曲小管上皮细胞(PTcells)和猪近曲小管上皮细胞株(LLC-PK1)活性氧簇的水平,并且这种效应呈剂量和时间依靠性,用活性氧簇探针H2DCF-DA检测到很多种氧自由基,包括超氧阴离子自由基(O-#2)、过氧化氢(H2O2)及羟基自由基(#OH)。OTA所致的活性氧簇的增加先于对细胞增殖的抑制,这提示氧化应激是产生细胞毒性的原因此不是结果。同时发现细胞内复原型谷胱甘肽浓度大

14、大降低,且在体外培养试验中发现OTA能导致8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)的生成。用250LgPkg的OTA染毒处理大鼠4周后,检测发如今血浆和肝肾匀浆中的丙二醛(MDA)含量均显著高于对照组,谷胱甘肽(GSH)含量和SOD、CAT、GSPx、GR活性均显著低于对照组26。各种生物体,包括细菌、动物、植物以及不同来源的培养细胞,在物理性、化学性及有害生物性刺激下具有共同的分子反响,即正常基因的表达抑制和一组特殊基因)热休克基因的激活和表达,并产生热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)作为/分子伴侣0介入蛋白质的折叠、转运及生物合成等经过,通过不同途径对细胞提供保护。目前普遍以

15、为HSP的功能主要是稳定细胞的构造,作为免疫监督剂和细胞保护剂,使细胞维持正常的功能。HSP在氧化应激后迅速发生的细胞损伤及随后的损伤修复经过和细胞增殖中均具有重要作用。用低剂量OTA处理LLC-PK1和MDCK细胞,尽管出现细胞增殖能力降低和乳酸脱氢酶(LDH)释放增加等细胞严重损伤的表现,但是热应激蛋白HSP70的水平并没有改变。这两种细胞系均能在热应激情况下诱导HSP70的生成,这表明细胞暴露于OTA阻止了HSP70的产生。体内试验在大鼠的肾脏也发现同样的情况。在细胞和组织中缺乏HSP70的保护作用可能是OTA产生累积毁坏效应的一个重要原因27。413其他的作用机制细胞间隙连接通讯(ga

16、pjunctionalinter-cellularcommunication,GJIC)能够协调不同组织、细胞间的代谢和电传导性,使各种信息有效地到达相应的细胞,保持细胞群体对生长刺激和调节反响的同步性,进而使细胞的增殖、分化按正常的程序进行28,故GJIC在胚胎发育、细胞分化和生长控制等经过中起重要作用。很多正常动物细胞都有间隙连接和细胞间信号传导,而肿瘤细胞间的GJIC减弱或消失。在癌变经过中,GJIC的阻断可能使开场癌变的细胞摆脱其周围正常细胞信息(生长抑制因子或抑癌因子等)的调控而克隆化扩增、发展构成肿瘤。除GJIC的改变外,肿瘤的细胞增殖经过还涉及对控制有丝分裂步骤的信号传导途径的诱

17、导,在此经过中,有丝分裂活化蛋白激酶(MAPK)如细胞外受体激酶(ERK)和p38等起重要作用。研究发现OTA在非细胞毒性剂量时即能不可逆地抑制小鼠肝细胞的GJIC,并且OTA对ERK和p38有较强的激活作用,但OTA却不是诱导细胞增殖,而是有很强的诱导细胞凋亡的作用29,其作用机制还有待进一步研究。此外,还发现OTA能抑制磷酸化酶活性而使糖原分解受阻,对己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性没有影响30。这可能是导致糖原在肝脏中聚集的重要原因。5结语OTA是污染农作物的一种较常见的真菌毒素,对动物和人的健康有很大潜在危害。随着对OTA毒性研究的深化,人们越来越重视它对人类健康的影响。至今全世界已经有11个国家制订了食品(150LgPkg)和动物饲料(1001000LgPkg)中OTA的限量标准。我国尚无粮食中OTA的限量标准,其检测方法也仅限于薄层色谱法和ELISA法,前者为半定量,后者尚未经仪器法验证。对OTA毒性的研究也极少2。因而发展快速、灵敏、易行的检测方法和生物标志体系,对OTA的生物学作用及其作用机制做更深化的研究,并尽快制订我国的OTA限量标准应是今后一段时间内此领域的研究重点。