细胞凋亡研究进展.doc

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1、第 29 卷 2007 年 6 月 第 3 期 45- 53 页 世界科技研究 与发展 W ORLD SC I TECH R& D V o . 29 Jun. 2007 N o. 3 pp. 45- 53 细胞凋亡研究进展 李 超 1 伏圣博 1 刘华玲 2 马欣 荣 2* ( 1. 四川大学生命科学学院 , 成都 610064; 2. 中国科学院成都生物研究所 , 成都 610041) 摘 要 : 细胞凋亡 ( apoptos is)是机体正常细胞 在受到 生理和 病理性刺 激 后出 现的一 种自发 的死亡 过程 , 是 一个主 动 、 高度有序 、 基因控制及一系列 酶参与的过程 。 细胞

2、凋亡在保证多细胞生物健康生 存过程中扮 演着关键角 色 , 对 个体的正常发育具有重要作用 。 它在多细 胞生物的组织 分化 、 器官 发育 、 机体稳 态的维 持中有 着重要 的意义 。 机 体在产生新生细胞的同时 , 衰老和突变的细胞通过凋 亡机制 而被清 除 , 使器官和 组织得 以正常 地发育 和代谢 。 细 胞凋亡发生异常会导致 疾病的发生 , 如肿瘤 、 自身免疫性疾病 、 病毒感染和神经 退化性疾病 等 。 由于细 胞凋亡的重 要意义 , 它在生物进化过程中不但得到了保留 , 而且从简 单的多细 胞生物 线虫 , 到高度 进化的 人类 , 细胞凋 亡机制 随着生物的进化得到了 发

3、展和完善 。 本文概述了细胞凋亡的特征 、 分子机制 、 信号途径 、 检测方 法及生物学意义 。 关键词 : 细胞凋亡 Caspase Bcl- 2 调亡途径 检测方法 生物学功能 R esearch Advan ces on Apop tosis L I Chao FU Shengbo L IU Hualing M A X inrong ( 1. School of L ife Science, Sichuan U niversity, Chengdu 610064; 2. Chengdu Inst itute o f B io logy, CA S, Chengdu 610041) Ab

4、strac t A poptos is is a spontaneous ce ll- suic ide pro cess trigg ered in response to phys io log ica l and patho log ical stress sti ul.i It is an in itia tive, tightly regu la ted and gene contro lled process invo lved in the partic ipa tion o f a se ries of enzym es. A poptos is play s a key ro

5、 le in the tissue d ifferentiation, org an developm ent and indiv idua l hom eostasis in mu ltice llular organ ism s by eli inating redundan t dam aged o r infected ce lls. A poptos is is assoc ia ted w ith d iseases. D erangement of apoptos is resu lts in d iseases such as cancer, auto- i m un ity,

6、 v ira l infections and neurodegenerative d isease. A poptosis ex ists ubiq u itously in m ulticellular organ ism s and evo lv es into h ighly odered pro cess. Th is rev iew focused on the cha racte ristics, mo lecu la r m echan ism s, detection m e thods, s igna l pathways, and b io log ica l signi

7、ficance of apoptos is. K ey word s: apoptosis, caspase, Bcl- 2, apoptotic pathw ays, de tection m ethods, biolog ica l sign ificance 引言 死亡 ( prog ramm ed cell death, PCD ) 2 。在 凋亡 和 细胞凋亡 ( apoptosis) 是指为维持内环境稳定 , PCD 中均涉及了 程序性 的概念。而事实上 , 两者 由基因控制的细胞自主的有序的死亡 , 最早是 1972 年由 K err 教授根据形态学特征首先提出的 。细 胞凋亡与

8、细胞坏死不同 , 细胞凋亡不是一件被动的 过程 , 而是主动过程 , 它涉及一系列基因的激活、表 达以及调控等作用。它并不是病理条件下 , 自体损 伤的一种现象 , 而是为更好地适应生存环境而主动 争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时 , 就像树叶 或花的自然凋落一样 , 该过程普遍存在于动物和植 物中。 长期以来 , 细胞凋亡往往又被称为程序性细胞 * 通讯作者 : 马欣荣 , Te: 028- 85252387; E - m ai:l m axr cib. ac. cn www. g lobesci com 的含义是不同的 , 最初提出的程序性细胞死亡 , 是描 述发生于各生物种系胚胎发育过

9、程中正常细胞死亡 的所有表型 , 具高度可遗传的时序性和空间性 , 即细 胞在发育的特定阶段按序死亡。细胞凋亡时间到来 时 , 需要另一种程序来提供细胞死亡的武器以控制 细胞发生主动的 自杀 过程 , 这种 手段程序 便是 细胞凋亡中 程序性 的含义。 另外 , 在形态学方面 , 细胞 凋亡与 PCD 也存在 着差异。在 发育过程中许多明显的程序性死亡并未 显示出凋亡中诸如细胞浓缩、染色质聚集、核酸内切 酶活化、凋亡小体等特 征。因此 , 有学者认为 PCD 是一种没有核酸内切酶诱导的 DNA 梯形带的出现 , 并常伴有自噬溶酶体活性 升高的细胞发育 死亡过 第 45 页 1 1 2 2* 1

10、 生物学 世界科技研究与发展 2007 年 6 月 程。严格地说 , 凋亡是一 形态学概念 3 , 是对多种 从而使 tTG 活化 7, 8 。 方式引起的一种特征性形态和生化改变的概括。它 并非代表引起细胞死亡的过程和路径 , 而是指众多 因素造成的众多死亡途径的最终 表现。 1 细胞凋亡特征 细胞凋亡的发生过程 , 在形态学上可分为三个 阶段 : ! 凋亡的起始。这一阶段的形态学变化表现 为细胞表面的特化结构如微绒毛的消失 , 细胞间接 触的消失 , 但细胞膜仍然完整 , 未失去选择透性 ; 细 胞质中 , 线粒体大体完整 , 但核糖体逐渐从内质网上 脱离 , 内质网囊腔膨胀 , 并逐渐与

11、质膜融合 ; 染色体 固缩 , 形成新月形帽状结构等形态 , 沿着核膜分布。 这一阶段经历数分钟 , 然后进入第二阶段。 凋亡 小体形成。首先 , 核染色质断裂为大小不等的片断 , 与某些细胞器如线粒体一起聚集 , 为反折的细胞膜 所包围。从外观上看 , 细胞表面产生了许多泡状或 芽泡状突起。以后 , 逐渐分隔 , 形成单个的凋亡小 体 。 # 凋亡小 体逐渐为邻近的细 胞所吞噬并消 化。从细胞凋亡开始 , 到凋亡小体的出现才数分钟 , 而整个细胞凋亡过程可能延续数小时 。 在 Caspase 家族半胱氨酸蛋白酶在凋亡中的关 键作用发现以前 , 人们所认识到的细胞凋亡的最主 要特征是 DNA

12、发生核小体间的断裂 , 结果产生含有 不同数量核小体单位的片段 , 在进行琼脂糖凝胶电 泳时 , 形成了特征性的梯状条带 ( DNA ladders) , 其大小为 180 200 bp 的整数倍。到目前为止 , 梯 状条带仍然是鉴定细 胞凋亡最可靠的 方法。催化 DNA 降解的是依赖于 Ca /M g 的核酸内切酶 , 而 Zn 则抑制其活性。 凋亡细胞的另一个重要特征是组织转谷氨酰胺 酶 ( tissue transg lutam inase, tTG ) 的积累并达到较高 的水平。 tTG 催化某些蛋白 质翻译后的修饰 , 主要 是通过建立谷氨酰胺和赖氨酸之间的交联以及多胺 掺入蛋白质而

13、实现的 , 其结果导致蛋白质聚合。这 类 蛋白聚合物不溶于水 , 不为溶酶体的酶所降解 , 它 们进入凋亡小体 , 有助于保持凋亡小体暂时的完整 性 , 防止有害物质的逸出。 tTG 只在不再分裂的、已 完成分化 的细胞中 处于 活性状 态。 tTG 是 依赖于 Ca 的酶 , 在生活正常的细胞中 , 由于 Ca 浓度较 低 , tTG 的活性很低 ; 当凋亡起始时 , Ca 浓度上升 , 第 46 页 细胞凋亡和细胞坏死 ( necrosis) 是两种截然不 同的细胞学现象。如前所述 , 细胞凋亡是一种主动 的由基因决定的细胞自我破坏的过程 , 而细胞坏死 则是极端的物理、化学因素或严重的病

14、理性刺激引 起的细胞损伤和死亡。二者是不同的生理过程。 细胞凋亡整个过程中 , 细胞膜的整合性保持良 好 , 凋亡细胞胞膜成分与结构的改变可以被吞噬细 胞表面的粘附分子及磷酯酰丝氨酸受体所识别 , 凋 亡小体为邻近的细胞所吞噬而降解 , 死亡细胞的内 容物不会逸散到胞外环境中去 , 所以凋亡的细胞不 引起局部炎症反应 , 也不引起周围组织的损伤。相 反 , 在细胞坏死时 , 细胞膜发生渗漏 , 细胞内容物 , 包 括膨大和破碎的细胞器以及染色质片断 , 释放到胞 外 , 导致炎症反应 。表 1 为细胞凋亡和细胞坏死的 主要区别 。 表 1 细胞凋亡与细胞坏死比较 T ab le 1 The c

15、om parisons be t een apoptosis and necros is 特征 细胞凋亡 细胞坏死 诱导因素 生理及弱刺激 强烈刺激 细胞数量 单个细胞丢失 成群细胞死亡 膜完整性 保持到晚期 早期即丧失 染色质 凝集呈半月状 稀疏 呈网状 细胞核 早期固缩断裂 晚期破碎 细胞器 无明显变化 肿胀、坏死 胞内容物 无释放 释放 细胞形状 形成凋亡小体 破裂成碎片 基因组 DNA 有控降解 随机降解 大分子合成 一般需要 不需要 基因调控 有 无 后果 不引起炎症反应 引起炎症反应 意义 生理死亡方式 病理死亡方式 细胞凋亡是一个主动的、信号依赖的过程 , 可以 由许多因素所诱导

16、 , 如放射线照射、毒素、药物、缺血 缺氧、病毒感染等。诱导因子大致可分为物理性诱 导因子包括射线 (如紫外线 , 射线等 ) 、较温和的温 度刺激 (如热激、冷激 )等和化学及生物诱导因子包 括活性氧基团和分子、钙离子载体、视黄酸、细胞毒 素、 DNA 和蛋白质合成的抑制剂、正常生理因子的 失调 , 肿瘤坏死因子等。 研究发现 , 这些因素大多可以通过激活死亡受 体而触发细胞凋亡机制。死亡受 体是近年发现的一 组细胞表面蛋白 , 属于肿瘤坏死因子受体超家族 , 它 们与相应的配体结合后 , 可以通过一系列的信号转 导过程 , 将凋亡信号向细胞内部传递。这个过程涉 及到多个家 族的蛋白质 ,

17、包括 TNF /TN FR 超家 族、 www. g lobesci. com 4 5 6 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2007 年 6 月 世界科技研究与发展 生物学 TRAF 超家族、死亡结构域蛋白质等 , 最终引起细胞 孔道。 Bax 能允许一些离子和小分子如细胞色素 c 凋亡的执行者 Caspase 蛋白酶家族的活 化 , 这些蛋 白酶剪切相应的底物 , 使细胞发生凋亡。 2 细胞凋亡的分子机 理 和细胞增殖一样 , 细胞凋亡也是受基因调控的 精确过程 , 其途径主要有两条 , 一条是通过细胞膜上 的死亡受体激活半胱氨酸蛋白酶 C aspase, 另一条是 通过胞质内的线粒体途

18、径释放细胞凋亡因子激活半 胱氨酸蛋白酶 Caspase。这些活化的 C aspase 可将细 胞内的重要蛋白降解 , 引起细胞凋亡。其中研究较 多的有 ICE、 A paf- 1、 Bc l- 2、 F as/APO - 1、 C - m yc、 p53、 ATM 等。与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌 基都参与对细胞凋亡的凋控 , 本文主 要探讨了 Bcl - 2、 C- m yc、 p53、 Caspase、 F as/A PO - 1 等的功能。 2. 1 Bc l- 2 基因家族 Bc l- 2 基因 , 最先在 B- ce ll leukem ia 中发现 , 由此命名。在细胞凋亡过程中

19、 , Bc l- 2 蛋白家族成 员起着至关重要的作用。它们具有较高的同源性 , 而且还 有 BH 1 ( B cl- 2 hom o logy dom ain 1 )、 BH 2、 BH 3、 BH 4 等保守结构域。 Bc l- 2 家 族可以分为两 大类 : 一 是抗凋亡的 , 主要有 Bc l- 2、 B cl- XL、 B cl- W、 M cl- 1 ( m ye lo id cell leukem ia- 1) 、 CED9 等 ; 二是促细胞死亡的 , 主 要包括 Bax、 Bak、 Bc l- X S、 Bad、 B ik、 B id 等。 B cl- 2、 B cl- X

20、L、 M cl- 1 等是细胞死亡的负调因子 , 在许 多类型的细胞受到外界刺激时能保 护细胞免于凋 亡 。 它们主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒 体外膜上 , 与膜的结合对于其发挥功能是极其重要 的。 线粒体膜上的 Bcl- 2 至少在三个水平上发挥 功能来抑制凋亡 : ! Bcl- 2 能改变线粒体巯基的氧 化还原状态来控制其膜电位从而调控细胞凋亡。在 细胞凋亡中 , 线粒 体的巯基可能组成了胞内氧化还 原电位的传感器 , Bcl- 2 可能是通过抑制谷胱甘肽 ( GSH )的外泄 , 降低胞内的氧化还原电 位 , 来抑制 细胞凋亡的。 Bcl- 2 能调节粒 体膜对一些凋亡 蛋白前体

21、的通透性。 B cl- 2 蛋白可能是线粒体 PT 孔道的组成成份 , 它在较高 pH 的条件下能形成离 子通道 , 而 Bax 则能在较为广泛的 pH 范围内形成 www. g lobesci com ( cytochrom e c) 等穿过线粒体膜 , 进入细胞质 , 从而 引起细胞凋亡 ; 而 Bcl- 2 的作用正好相反 , 它能封 闭 Bax 形成孔道的活性 , 使一些小分子不能自由通 透 , 从而保护细胞免于凋亡。 # Bcl- 2 能将凋亡蛋 白前体 A paf- 1( apoptot ic protease activating factor- 1) 等定 位 至 线 粒 体

22、膜 上 , 使 其 不 能 发 挥 凋 亡 作 用 。 2. 2 C - m yc 与细胞凋亡 c- m yc 属于原癌基因 , 对细胞具有两 方面的 作用 , 既可参与细胞的增生转化 , 又可诱导或促进细 胞凋亡的发生 , 是一种早期快反应基因。它的表达 可以使细胞从 G0 期过渡到 G1 期 , 细胞周期变短 , 分 裂加速 。而在细胞分化时 , c- m yc 表达降低 , 细 胞生长受到抑制。 c- m yc 可以诱导成纤维细胞、杂 交瘤 T 细胞、白血病细胞等发生凋亡 , 且这种作用 可因 B cl- 2 或突变型 p53 的表达而被抑制 。 2. 3 抑癌基因 p53 抑癌基因 p

23、53 编码产物与肿瘤的发生、发展相 关 , 为肿瘤抑制基因。 p53 可分为 两种类型 , 一种是 可诱导细胞发生凋亡的野生型 , 另一种是具有抑制 凋亡能力的突变型。野生 型 p53 是作为细胞周期 G1 的控制蛋白而发挥作用的 , 当 DNA 损伤时 , p53 编码的转录活化蛋白聚集在 DNA 损伤部位 , 使 DNA 受损细胞停止在 G1 期 , 阻止 DNA 复制 , 从而 使 DNA 得到修复 , 若 DNA 受损细胞 修复失败 , 则 p53 介导细胞凋亡。如果 DNA 受损细胞逃脱了 p53 的监控 , 细胞就在遗传物质变异的基础上不断增殖 而癌变。 2. 4 C aspase

24、 蛋白酶 家族 C aspase 蛋白酶参与 F as 诱导的细胞凋亡 , 与线 虫细胞凋亡基因 C ed- 3 同源 , 能选择性降 解蛋白 质。 C ed- 4 在哺乳动物中的同源体为 A paf- 1, 能 激活 Caspase- 3, 这一过程需要细胞色素 c( A paf- 2)和 A paf- 3 的参与 。 C aspase 属于半胱氨酸蛋白酶 , 这些蛋白酶是引 起细胞凋亡的关键酶 , 一旦被信号途径激活 , 能将细 胞内的蛋白质降解 , 使细胞不可逆地走向死亡。它 们均有以下特点 : ! 酶活性依赖于半胱氨酸残基的 亲核 性 ; 总是在天冬氨酸之后切断底物 , 所以命名 为

25、Caspase( cysteine aspartate- specific protease) , 方 第 47 页 10 生物学 世界科技研究与发展 2007 年 6 月 便起见本文称之为凋亡酶 ; # 都是由两大、两小亚基 组成的异四聚体 , 大、小亚基由同一基因编码 , 前体 的 活性 , 但目前还未发现在哺乳动物中发现 C rmA 的同源分子。 p35 和 被切割后产生两个活性亚基。 FL IP s( FL ICE - i hibiro ry proterins)能抑制 Fas/ 20 最早发现人类中与线虫 ced- 3 同源的基因是 TN FR 1 介导的细胞凋亡 。它有多种变异体

26、, 但 N ICE, 因该酶 能将 白介素 前体 切割 为活 性分子 , 故 名。通过 cDNA 杂交和查找基因组数据库 , 在人类 细胞中已 发现 11 个 ICE 同 源 物 , 分 为 2 个 亚族 ( subgroup) : ICE 亚族和 CED - 3 家族 , 前者参与炎 症反应 , 后者参与细胞凋亡 ; 又分为两类 : 一类为执 行者 ( executioner 或 effector) , 如 caspase- 3、 6、 7, 它 们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白 , 引起凋 亡 , 但不能通过自催化 ( au tocata ly tic) 或自剪接的方 式激活 ; 另一

27、类为启动者 ( in it ia tor) , 如 caspase- 8、 9, 受 到 信号 后 , 能 通过 自 剪接 而 激活 , 然 后 引起 caspase 级联反应 , 如 caspase- 8 可依次激活 caspase - 3、 6、 7 。 细胞中还具有 caspase 的抑制因子 , 称为 IA Ps ( inhibitors o f apoptosis proteins) , 属于一个庞大的蛋 白家族。它们能通 过 BIR 结 构域 ( baculovirus IA P repeats dom ain)与 caspase 结合 , 抑制其活性 , 如 X I A P 。

28、2. 5 F as 与细胞凋亡 F as( 又称 A PO - 1 或 CD 95) , 与 B cl- 2 基因是 凋亡相关基因中作用 相反的两个典型 代表。其为 TNFR 家族成员 , 基因产物为一跨膜糖 蛋白。与其 配体 FasL 或 F as 抗体结 合后 , 经特 殊胞内 蛋白介 导 , 直接激活凋亡基因产物 , 诱导 Fas 蛋白所在的细 胞凋亡。有研究表明 , 某些细 胞在发生、发展过程 中 , Fas 基因的表达不断加强 , 而凋亡抑制基因 Bcl - 2 的表达逐渐减少 , 最终导致细胞凋亡的发生 , 完 成细胞代谢过程 , 达到细胞增殖与凋亡的平衡 。 2. 6 凋亡抑制分

29、子 迄今为 止 , 已 发 现 多种 凋 亡 抑 制 分 子 , 包 括 p35、 C rmA、 IA Ps、 FL IPs、 B cl- 2 家族。 p35 和 C rmA 是广谱凋亡抑制剂 , 是由病毒基因所编码的蛋白质。 p35 来自于杆状病毒 , C rmA 来自牛痘病毒。体外研 究结果表明 p35 以竞争性结合方式与靶分子形成稳 定的具有空间位阻效应的复合体并且抑制 C aspase 活性 。同时 被靶 Caspase 特异 切割后 的 p35 与 Caspase 的结合更强 , C rmA ( Cytokine response m odfer A ) 是血清蛋白酶抑制剂 , 能够

30、直接抑制多种蛋白酶 第 48 页 - 端功能前区完全相同 , C 端长短不一。 FL IP s 通过 DED 功能区 , 与 FADD 和 Caspase- 8, 10 结合 , 拮抗 它们之间的相互作用 , 从而抑 制 C aspase8, 10 募集 到死亡受体复合体和它们的起始化。 3 细胞凋亡途径 3. 1 细胞膜上的死亡受体途径 细胞凋亡的膜受体通路 : 各种外界因素是细胞 凋亡的启动因子 , 它们可以通过不同的信号传递系 统传递凋亡信号 , 引起细胞凋亡 , 以 Fas- F asL 为例 说明。 Fas 是一种跨膜蛋白 , 属 于肿瘤坏死因 子受体 超家族成员 , 它与 FasL

31、 结合可以启动凋亡信号的转 导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤 : 首先 配体诱导受体三聚体化 , 然后在细胞膜上形成凋亡 诱导复合物 , 这个复合物中包括带有死亡结构域的 Fas 相关蛋白 FADD 。 Fas 又称 CD 95, 是由 325 个 氨基酸组成的受体分子 , Fas 一旦和配体 FasL 结合 , 可通过 Fas 分子启动致死性信号转导 , 最终引起细 胞一系列特征性 变化 , 使细胞死亡。 F as 作 为一种 普遍表达的受体分子 , 可出现于 多种细胞表面 , 但 FasL 的表达却有其特点 , 通常只出现于 活化的 T 细 胞和 NK 细胞 , 因而已被活化的杀伤性

32、免疫细胞往 往能够最有效 地以凋亡 途径置靶 细胞于死 地 。 Fas 分子胞内段带有特殊的死亡结构域 ( DD, death dom ain) 。三聚化的 Fas 和 FasL 结合后 , 使三个 Fas 分子的死亡结构域相聚成簇 , 吸引了胞浆中另一种 带有相同死亡结构域的蛋白 FADD。 FADD 是死亡 信号转录中的一个连接蛋白 , 它由两部分组成 : C 端 ( DD 结构域 )和 N 端 ( DED ) 部分。 DD 结构域负责 和 Fas 分子胞 内段上的 DD 结构域结合 , 该蛋白再 以 DED 连接另一个带有 DED 的后续成分 , 由此引 起 N 段 DED 随即 与无

33、活性 的 半胱 氨酸 蛋白 酶 8 ( caspase - 8 ) 酶 原 发 生 同 嗜 性 交 联 , 聚 合 多 个 C aspase- 8 的分子 , Caspase- 8 分 子逐由单链酶原 转成有活性的双链蛋白 , 进而引起随后的级联反应 ( cascade), 即后者作为酶原而被前者激活 , 引起下 www. g lobesci. com 16 17 18 19 2007 年 6 月 世界科技研究与发展 生物学 面的级联反应 , 细胞发生凋亡。因而 TN F 诱导的细 胞凋亡途径与此类似 。 3. 2 内质网的凋亡信号途径 内质网功能的有效发挥 , 是保证细胞活动和生 存的关键。

34、当内质网处于被干扰的状态下 , 未能折 叠的蛋白质将会在其区域聚集。内质网膜上的受体 一旦探测到了施加于内质网的干扰 , 将会起始非折 叠蛋白 反应 ( U PR ) , 以保 证内质 网的 正常生 理功 能。如果这种干扰一直继续 , 而应急反应没有发挥 作用 , 那么细胞就会启动凋亡程序 。内质网的凋 亡信号途径主要是通过内质网内释放的蛋白质分子 与 Caspase 蛋白家族中的 C aspase- 8 以及其他蛋白 如 Bap31、 IRE1 等组合成蛋白质复合物 , 作用于 Bcl - 2 家族中的 B id、 B i , 进而作用于线粒体 , 进入线 粒体通路的细胞凋亡信号途径 。 3

35、. 3 线粒体的凋亡信号 线粒体是细胞生命活动控制中心 , 它不仅是细 胞呼吸链和氧化磷酸化的中心 , 而且是细胞凋亡调 控中心。研究表明了细胞色素 c 从线粒体释放是细 胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素 c 在 dAT P 存在的条件下能与凋亡相关因子 1( A paf- 1) 结合 , 使其形 成多聚体 , 并促使 Caspase- 9 与 其结合形 成凋亡体 ( apoptosom e) , Caspase - 9 被激 活 。被激 活的 C aspase - 9 能激 活其 它的 Caspase 如 Caspase - 3 等 , 从而诱导细 胞凋亡。此 外 , 线粒体还释放凋

36、亡诱导因子 , 如 A IF, 参与激活 Caspase。可见 , 细胞凋亡体的相关组份存在于正常 细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素 c 释 放和凋亡体的形成。很显然 , 细胞色素 c 从线粒体 释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。 多数凋亡刺激因子通过线 粒体激活细胞凋亡途经。 有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素 c 从线 粒体的释放 作为 凋亡诱 导因 子 , 细胞 色素 c 能与 A paf- 1、 Caspase - 9 前体、 AT P /dATP 形成凋亡体 , 然后召集并激活 C aspase- 3, 进而引发 Caspases 级 联反应 , 导致细胞凋亡。

37、在这里 , 一个核心的问题是 细胞色素 c 究竟通过哪一种途径释放到细胞质中 , 由于大部分凋亡细胞中很少发生线粒体肿胀和线粒 体外膜破裂的现象 , 所以目前普遍认为细胞色素是 通过线粒体 PT 孔或 Bc l- 2 家族成员形成的线粒体 跨膜通道释放到细胞质中的。 www. g lobesci com 线粒体 PT 孔 ( perm eab ility transition pore) 主要 由位 于 内 膜 的 腺 苷 转 位 因 子 ( adenine nucleotide translocator, ANT ) 和位于外膜的电压依赖性阴离 子通道 ( vo ltage dependen

38、t anion channe, VDA C ) 等蛋白所组成 , PT 孔开放会引起线粒体跨膜电位下 降和细胞色素 c 释放。 B cl- 2 家族蛋白对于 PT 孔 的开放和关闭起关键的调节作用 , 促凋亡蛋白 B ax 等可以通过与 ANT 或 VDAC 的结合介导 PT 孔的开 放 , 而抗凋亡类蛋白如 Bc l- 2、 Bc l- xL 等则可通过 与 Bax 竞争性地与 ANT 结合 , 或者直接阻止 Bax 与 ANT、 VDA C 的结合来发挥其抗凋亡效应。 Bcl- 2 家族的结构和能 形成离子通道 的一些 毒素 ( 如大肠杆菌毒素 ) 非常相似。插入膜结构中 形成较大的通道

39、, 允许细胞色素 c 等蛋白质通过 , 这 可能是细胞色素 c 释放的另一个途径。 上述三条信号途径 , 最终都是集中到线粒体来 执行凋亡过程。现在一般认为细胞凋亡的途径仍然 主要有两条 , 即胞膜上的死亡受体途径和胞质内的 线粒体途径 , 而内质网的凋亡信号途径往往归并于 线粒体途径。线粒体在细胞凋亡中的核心地位如图 1 所示。 3. 4 两种最新发现的凋亡形式 在诱导细胞凋亡或者细胞程序性死亡的诸多因 素中 , 细胞间质是被研究最多的对象。而与细胞连 接 有 关 的 细 胞 凋 亡 被 称 之 为 失 巢 凋 亡 ( ano ik is) , 其中失巢的意思即是指细胞间失去了 粘着。而失巢

40、凋亡的起始 , 通常都是从抗粘着的物 质开始 的。此 通路 中所 涉及到 的关 键酶 有 EGF, EG FR, ERK, JNK s 等 , 其发挥作用最终也要通过 B cl - 2 蛋白家族和线粒体 。 A sher 等人首 次提 出了副 凋亡 ( para - apopto sis) 的概念 , 其典型特征是由线粒 体和内质网肿胀 造成的胞浆空泡化 。与坏死不同 的是 , 副凋亡并 不出现细 胞膜的破坏。最近 , Sperandi 等人 对一种 非凋亡形式的程序性细胞死亡进行了深入研究 , 他 们将其称为 paraptosis 。与凋亡相比 , 副凋亡形式 的程序性细胞死亡有着截然不同的

41、形态学特点。当 细胞发生副凋亡时 , 细胞体积变大 , 电子显微镜下观 察可见细胞内出现大量由线粒体和内质网肿胀形成 的胞浆空泡。发生自噬性程序性细胞死亡的细胞在 电镜下观察也可看到大量的胞浆空泡 , 但这种空泡 第 49 页 23, 24 25 26 27, 28 29 31 32 33 生 物学 世界科技研究与发展 2007 年 6 月 来源于溶酶体 , 与副凋亡中的空泡来源不同。但迄 今为止 , 关于副凋亡的研究报道还不是很多。 图 1 细 胞凋亡途径 Fig. 1 T he pathw ays o f apoptosis 综上所述 , 细胞凋亡所涉及到的多条信号途径 , 最终都是集中到

42、线粒体来执行凋亡过程。线粒体既 4. 1 形态学观察 形态学观察 , 就是应用各种染色法可观察到凋 是细胞的能量工厂 , 也是细胞的凋亡控制中心。线 粒体会担负起如此重要的双重功能 , 一个主要的原 因是各类生长因子都可以促进葡萄糖转运和己糖激 酶等 向线粒体转运、加速能量生产 , 而剥夺生长因子 后 , 细胞氧消耗降低、 ATP 合成不足、蛋白质合成受 阻 , 最后细胞走向死亡。由于这一方面的资料较少 , 目前还很难做出一个较好的解释 , 只能留在以后再 完善。 4 细胞凋亡检测方法 细胞凋亡的检测是基于凋亡细胞所形成的形态 学和生物化学的特 征 , 特 别是 DNA 的断 裂等。因 此 ,

43、 常用的细胞凋亡检测方法有 : 第 50 页 亡细胞的各种形态学特征 , 如组织切片或细胞涂片 经 固 定 , 用 G iem sa 染 色、孚 尔 根 染 色 或 H oe chest33342 等荧光染色 , 在光学显微镜下镜检 , 可观 察到染色质凝集、边缘化、凋亡小体出现、巨噬细胞 的吞噬等现象 。孚 尔根染色、 DNA 荧光染 色可 显示 染 色 质 凝 集、断 片 等 现 象。 台 盼 蓝 ( trypan b lue) 染色 , 凋亡细胞不能着色 , 而坏死细胞呈蓝色 , 表明凋亡细胞的质膜仍保持完整性。坏死细胞质不 浓缩而是明显肿胀 , 无凋亡小体。组织切片中坏死 灶周围有炎症

44、发生 , 淋巴细胞集中。而凋亡细胞在 组织切片中是分散的 , 数量少 , 常迅速为吞 噬细胞所 吞噬。电子显微镜下凋亡细胞的核缩小 , 染色质边 缘化、凝集、电子密度高。晚期则形成核碎片与胞质 内的细胞器混合在一起被细胞膜包围的凋亡小体 , www. g lobesci. com 2007 年 6 月 世界科技研究与发展 生物学 被巨噬细 胞所吞噬。 根据凋亡细胞固有的形态特征 , 人们已经设计 了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 4. 2 DNA 电泳 提取细胞基因组 DNA, 进行常规的琼脂糖凝胶 电泳 , 并用溴化乙锭 进行染色时 , 凋亡细胞的 DNA 显示出 180 200 bp 及其不同倍数的梯带 , 这被视 为最典型的凋亡指标。而坏死细胞的 DNA 电泳时 呈弥散的涂抹状。 4. 3 彗星电泳法 彗星电泳法 ( com et assay) , 原理是将单个细胞 悬浮于琼脂糖凝胶中 , 经裂解处理后 , 在电场中进行 短时间的电泳 , 并 用荧光染料染色。凋亡细胞中形 成的 DNA 降解片断 , 在电场中泳动速度较快 , 使细 胞核呈现 出一种 彗星式 的图 案 ; 而正 常细胞 的无 DNA 断裂的核在泳动时保持圆球形 , 这是一种快速 简便的检测凋亡细胞的方法。 4. 4 TUNEL 测定法 TUNEL 测定法 ( term inal deoxynuc