宏基因组学(Metagenomics)的研究现状和发展趋势.doc

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1、第 28 卷第 2 期 环 境 科 学 学 报 V o . 28, N o. 2 2008 年 2 月 贺纪正 , 张丽梅 , A cta Scientiae C ircum stan tiae 沈菊培 , 等 . 2008. 宏基因组学 (M etagenom ics)的研究现状和发展趋势 J. 环境科学学报 , 28( 2 ): 209- 218 F eb. , 2008 H e J Z, Zhang L M, Shen J P, e t al. 2008. Advances and perspectives ofm etagenom ics J. Acta Scientiae C irc

2、um stantiae, 28( 2 ): 209- 218 宏基因组学 贺纪正 , 张丽梅 ( M etagenom ics)的研究现状和发展趋势 , 沈菊培 , 朱永官 1. 2. 城市与区域生态国家重点实验室 , 中国科学 院生态环境研究中心 , 北京 100085 中国科学院研究生院 , 北京 100049 收稿日期 : 2007 05 14 录用日期 : 2007 12 04 摘要 : 随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用 , 促进了以环境中 未培养微生物为 研究对象的 新兴学科 微生物环境基因组学 (又叫宏基因组学、元基因组学 , M eta

3、genom ics)的产生和快速发展 . 宏基因组学 通过直接从环境 样品中提取 全部微生物的 DNA, 构建宏基因组文库 , 利用基因组学的研究策略研究环境样品所包 含的全部微生物 的遗传组 成及其群 落功能 . 在短 短几年 内 , 宏基因 组学研究已渗透到各个领域 , 包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等 , 并 在医药、替代能 源、环境修复、生 物技术、农业、 生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值 . 对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 , 建议在我国尽快启动有关宏 基因组学的研究 , 从国家层面上开展联合攻关 , 拓展当前的研究领域 , 发展相关

4、研究策略和技术 , 开展广泛的国际合作 , 使我国在宏基因组学研 究领域占据有利地位 . 关键词 : 环境基因组学 ; 宏基因组学 ; 基因组文库构建 ; 文库筛选 ; 研究前沿 文章编号 : 0253 2468 ( 2008) 02 209 10 中图分类号 : X171 文献标识码 : A Advan ces and perspectiv es of m etagenom ics HE Jizheng , ZHANG L i e i, SHEN Jupe i , ZHU Y ongguan 1. State Key Laboratory ofUrban and RegionalE colo

5、gy, Research Cen ter forE co Environm en tal Sciences, Ch in eseA cad em y of Scien ces, B eijing 100085 2. Gradu ate Un iversity of Ch inese Acad emy of Scien ces, Beijing 100049 R eceived 14 M ay 2007; accepted 4 Decemb er 2007 A bs tract W ith th e developm ent of m olecu lar b iology and its app

6、 lication in m icrobial ecology and environm en tal m icrob iology, a em erging field of m etagenom ics ( env ironm en tal genom ics or ecogenom ics), has been developed rap id ly. M etagenom ics, com prising extracting total comm un ity DNA, constru cting genom ic lib rary, and an alyzing library w

7、 ith si ilar strateg ies for fun ctional genom ics, provides a pow erful tool to study th e uncu ltured m icroorgan ism s in the comp lex environm en tal hab itats. In recen t years, m etagenom ics has been app lied to m any environm ental sam p les, such as th e oceans, so ils, therm al ven ts, hot

8、 springs, and the hum an mouth and gastrointes tinal tract show ing sign ificant value in variou s areas includ ing m ed icin e, alternative energy, environm en tal rem ed iation, b iotechn ology, agricu lture, b iodefense and forens ics. Th is rev iew summarized som e m ajor advan ces in m etagenom

9、 ics and called to prom ote the m etagenom ic research in Ch ina by listing it as a national research priority and supporting a cluster of pro jects th rough the national fund ing agen cies such as the N atural Scien ce Found ation of Ch ina. Keywords: env ironm ental genom ics; m etagenom ics; lib

10、rary construction; library screen ing; fron tier of scien ce Sciences)于 1998 年启动了环境基因组计划 ( EG P, 随着人 类基 因 组计 划 ( HGP, H um an G enom e Environm enta l G enom e P ro ject), 开展 有关人体遗 传 P ro ject)的实施和推进 , 促使了基因组功能性研究计 变异与环境胁迫响应的研究 , 引起各国科学家的极 划的开展 , 因此 , 也从 结构基因组学研 究时代进入 大关注 , 它标志着生命科学界将在更深层次上对环 了 后基因

11、组时代 . 美 国国立 环境 卫生科 学研 究所 境与基因相互作用对人类健 康的影响进行系 统全 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( No. 40571082, 50621804); 国家重点基础研究发展规划资助项目 ( No. 2005CB121105 ) Supported by the NationalNatu ralS cien ce Foundation of Ch ina (N o. 2005CB121105 ) 40571082, 50621804 ) and th eM in istry ofS cien ce and T echnology ofC h ina (No.

12、作者简介 : 贺纪正 ( 1965 ), 男 , 研究员 (博士 ), E m ai: jzhe rcees. ac. cn; * 通讯 作者 (责任作者 ) Biography: H E J izheng( 1965 ), m ale, p rofessor( Ph. D. ), E m ai: jzh e rcees. ac. cn; * Corresponding author 1, * 1 1, 2 1 1, * 1 1, 2 1 ( N IEH S, N ational Institute o f Environm enta l H ea lth 1 引言 ( Introduct i

13、on) 210 环 境 科 学 学 报 28 卷 面的探 索和 研究 ( www. niehs. n ih. gov / envgenom e / 点和前沿 . hom e), 环境基因组学 ( environm enta l genom ics) 由此 2007 年 3 月 , 美 国 国 家 科 学 院 联 合 会 ( The 应运而生 . 但是 , 至今 对环境基因组学 还没有统一 N at iona l A cadem ies, 包 括 N at iona l A cadem y of 明确的定义 . 总的来说 , 环境基因组学 建立在对疾 Sciences, N ational A

14、cademy of Eng ineering, Institute 病病因认识的基础上 , 深入探讨环境胁迫 基因、基 o fM edic ine, N at iona l R esearch Counc il) 以 环境 基 因 基因间交互作用 . 环境基因组学的目标是研究环 因组学新 科 学 揭示微 生物世 界的 奥秘 ! ( The 境胁迫对机体遗传变异的过程和机理 , 包括发掘环 境应激和应答基因的多态性 , 探究这些多态性基因 的功能及其与患病风险的关系 , 其与毒理基因组学 ( T ox icogenom ics)密切相关 , 是在人类基因组基础上 发展的功能基因组学内容之一 .

15、在微生物学研究领域中 , 因为 99% 以上的微生 物都是目前未 (难 ) 被纯培养的 , 过去人们对微生物 世界的认 识基本上都集 中在不到 1% 的 微生物上 ( K ellenberger, 2001) . 在自然条件下 , 微生物广泛参 与 C、 N、 O 和 S 等重要元素的循环转化 , 并在人体的 食物消化、毒素降解及机体 免疫反应、环境污染物 降解等方面发挥着重要作用 ; 微生物通过其群落而 非单一个体来执行这些重要功能 , 而目前人们对微 生物的认识主要基于实验室纯培养的 单一微生物 物种 , 对微生物群落作为整体的功能的认识远远落 后于对其个体的认识 . 因此 , 自 199

16、1 年 Pace 首次提 出环境基因组学的概念并在同年构建 了第一个通 过克隆 环境样品中 DNA 的噬菌体文库以来 , 有关环 境基因组学 ( 也称 微生 物环 境基因 组学 M icrob ial Env ironm en tal G enom ics, 宏 基因 组 学、元基 因 组学 M etagenom ics, 生态基因组学 E cogenom ics) 的研究受 到广泛关注 . 环境基因组学主要研究从环境样品获 得的基因组中所包含的微生物的遗传 组成及其群 落功能 , 避免了传统微生物学基于纯培养研究的限 制 , 为充分认识和开发利用 未培养微生物、并从完 整的群落水平上认识微生

17、 物的活动提供了可能 . 对 这些未培养微生物多样性及群落功能 的研究将大 大扩展我们对生命的了解 , 包括了解生命如何耐受 极端环境、新的生物能源、生命进化以 及微生物与 环境之间的相互作用 . 微生物环境基因组学为最大 限度地挖掘微生物资源带来了前所未有的机遇 , 已 经成为国际生命科学技术研究和开发 最重要的热 N ew Sc ience ofM etagenom ics: R evea ling the Secrets of O urM icrob ial P lanet) 为题发表咨询报告 , 认为宏基 因 组学科学的出现为我们探 索微生物世界的 奥秘 提供了新的方法 , 这可能是继

18、发明显微镜以来研究 微生物方法的最重要进展 , 将带来对微生物世界认 识的革命性突破 . 报告呼吁建立全球宏基因组学研 究计划 ( G loba lM etagenom ics Initiative) , 建议大批量 启动中小型宏基因组学研究项目 , 对自然环境微生 物群落 (如海水或土壤 )、寄生微生物群落 ( 如人体 肠胃或口腔 )、人为控制环境微生物群落 (如污水处 理厂或水产养殖厂 ) 等展开研究 ; 启动少 量大型综 合性项目 , 对 宏基因组学研究方法、技术路线、理论 框架和更为复杂的动态微生物系统进行研究 . 本文以下就宏基因组学 ( M etagenom ics) 的研究 方法

19、、热点内容和发展前景进行探讨 . 2 环 境 基 因 组 学 的 研 究 方 法 ( M ethodo logy of m etagenom ics ) 环境基因组学的研究以基因组学技术为依托 , 其主要的程序包括 : 从环境样品 ( 例如土壤 ) 中直接 提取 DNA; 将 DNA 克隆到合适的载体中 ; 将载体转 化到宿主细菌建立环境基因组文库 ; 对得到的环境 基因组文库进行分析和筛选 ( 图 1) . 其中 , 基因组文 库的构建是揭示新基因的前提 , 接下来则是如何有 效地利用文库中丰富的 资源 , 挖 掘新的生物分子 . 由于环境基因组的高度复杂性 , 需要通过高通量和 高灵敏度的

20、方法来筛选和鉴定文库中的有用基因 . 筛选技术大致可分为 3 类 : 第 1 类基于核酸序列差 异分析 (序列驱动 ), 第 2 类基于克隆子的特殊代谢 活性 ( 功能 驱动 ) , 第 3 类基于底 物诱导基因的 表 达 , 第 4 类基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交 在内的其它技术 . 2 期 贺纪正等 : 宏基因组学 (M e tagenom ics)的研究现状和发展趋势 211 图 1 微生物环境基因组文库构建与筛选流程示意图 (沈菊培等 , 2007) F ig. 1 Con struction and screen ing strategies of m etagenom ic

21、lib rary ( Sh en e t al. , 2007) 2. 1 序列分析法 ( Sequence driven screen ing m ethod) DNA 序列分析 技术是现代生命科学研究的核 基因的功能 , 进而追踪一些能够高效表达或控制微 生物 群 落 重 要 功 能 的 关 键 基 因 . 例 如 , Sebat 等 心技术之一 , 是发现和认识基因多态性的前提 . PCR ( 2003) 利用微序列平台对整个微生物群 落基因组 是序列分析中最常用的技术 , 对目标序列特异的探 针杂 交 技 术 也 已 被 用 于 土 壤 基 因 文 库 的 筛 选 ( K nietsc

22、h et al. , 2003) . 序列分析法需要根据已知 的基因和基因表达产物的保守序列设 计引物和探 针 , 因此 , 对鉴定新的基因成员有一定的局限性 , 但 它已被有效地用于鉴定系统发育学中 的标志基因 ( 如 16S rRNA 基因 ) 和 带有高度保守 域的酶基因 (如聚酮化合物合成酶、葡萄糖酸还原酶和腈水合 酶等 ) ( D an ie, 2005) . PCR 方法往往只能获得部分 基因的扩增 , 而要从复杂的土壤基因组文库中分离 到全长基因则比较困难 . Stokes 等 ( 2001)用整合子 基因盒系统巧妙地解决了这个问题 . 整合子由 1 个 整合酶基因和 1 个含

23、59 bp 的重组位点组成 , 基因 盒可从这个特异的重组位点插入并将 这个位点分 隔开与之比邻 , 被分隔开的这些位点常含有约 25 bp 的保守序列 ( 反向重复序列 ), 以这些保守位点序列 作为 PCR 引物扩增即可获得基因盒中的全长基因 . 微序列技术 ( M icroarray) 采用集约化和平面处 理原理 , 在微小片基上高密度而有序地排列大量基 因片段、 EST 或寡核苷酸片段 , 从而形成 DNA 微矩 阵 , 又称基因芯片 . 利 用微阵列技术研 究微生物环 境基因组 , 可以了解环境样品中微生物群落结构及 其基因表达图谱和新的代谢途径 , 快捷地探测未知 进行筛 选 ,

24、鉴定 出 多 个新 的 微 生物 种 群 . W agner ( 2006) 等应用 DNA 微阵列技术对活性污泥中微生 物的群落结构进行了研 究 , 获得 了大量新的信息 . 但是 , 利用该技术进行基因检测的灵敏度为 PCR 法 的 1 /100 1 / 10000. 这种差异将会阻碍土壤中低丰 度微生物的序列分析 . 因此 , 提 高灵敏性和专 一性 是应用微阵列技术研究复杂土壤中 DNA 和 RNA 信 息所面临的重要挑战 . 对基因组文 库的随机测序 可以获得丰富 的 信 息 , 但需要进行大量 的测序和分析工 作 , 测序 技术 的日益 改 进 促 进 了 该 技 术 的 发 展

25、. 焦 磷 酸 测 序 ( Pyrosequenc ing) 技术比较适合于验证一 些只有几 十个碱基对的短序列 DNA 片段 , 很适合进行大样本 的快速检测 . 最近新发展了一种利用皮升 ( P ico litre) 级反应器进行测序的方法 , 这种方法是在焦磷酸盐 测序法的基础上结合一种乳 胶材料和皮升级 反应 孔 , 将基因组 DNA 进行随机切割 , 批量地进行整个 测序反应 . 利用这个 方法 , 能 够 在相同的时间 内破 译 6 10 组以 上的基 因组序 列 , 比 Sanger 法要 快 100 倍 , 提高了测序的效率 ( M argu lies et al. , 200

26、5) . 另外 , 鸟枪法测序 ( Shotgun sequenc ing ) 策略则为大 规模测序提供了技术保障 , 该方法首先将一条完整 的目标序列随机打断成小 的片段 , 分 别测序 , 然后 212 环 境 科 学 学 报 28 卷 利用计算机根据序列间的重叠关系进 行排序和重 新 组 装 , 并 确 定 它 们 在 基 因 组 中 的 正 确 位 置 ( F alkow ski et al. , 2004). 应用这种方法研究环境基 因组学为筛选新的天然产物提供了一 种可选择的 途径 , 并可产生大量的信息 , 从中挖掘 上百万个新 基因 , 揭示不可培养微 生物的代谢途径 . 然而

27、 , 鸟枪 法的不足之处是耗费大 , 需大量人力和物力 . 同时 , 与个体微生物基因相比 , 环境基因组文库包含着巨 大的序列片段 , 但对这些序列片段进行分析则极为 困 难 . 最 近 , 研 究 人 员 报 告 了 一 种 简 化 的 叫 Phy loPyth ia 序列分类的新技术 , 可利用 340 个复杂 基因组的信息对来自复杂生态环境的 序列片段进 行分类组装 , 这是以前的方法所做不到的 ( M cH ardy et al. , 2007) . 2. 2 功能性筛选法 ( Function driven screen ing m ethod) 功能性筛选法以活性测定为基础 ,

28、通过建立和 优化合适的方法从基因组文库中获得 具有特殊功 能的克隆 . 绝大部分新发现的生物催化剂或分子化 合物是利用这种方式筛选得到的 . 功能性筛选的方法有 2 种 . 一种是对具有特殊 功能的克隆子进行直接检测 , 如利用其在选择性培 养基上 ( 如含有化学染料和不可溶的或发光的酶反 应底物 ) 的表型特征进行筛选 . 这种方法具有较高 的灵敏度 , 使得较少的克隆子也能被检测到 . 例如 , 插入了土壤基因组片段的克隆子可以 利用培养基 中的多羟基化合物合成羰基化合物 , 由此可从土壤 基因组文库中筛选到多羟基氧化还原酶基因 . 另一 种方法是基于异源基因的宿主菌株与 其突变体在 选择

29、性条件下功能互补生长的 特性进行的 . 例如 , 从以缺陷型大肠杆菌为宿主建立的一 个土壤基因 组文库中 , 筛选出了与 N a /H 反相转运通道有关 的 2 个新基因 ( D anie,l 2005) . 通过功能性筛选 的方法可以快速 地从多个克 隆子中鉴定出全长基因 , 并由此获得这些功能基因 的产物 , 为工业、医药 和农业提供一些 具有潜在活 性 的天然产物或 蛋白质 . 但 是 , 这个方 法最大的不 足在于筛选方法必须依赖于功能基因 或编码功能 蛋白在外源宿主中的表达 , 这也往往会由于许多基 因或基因产物在外源宿主中的不表达 或表达后没 有活性而降低了筛选效率 . 只有通过对

30、筛选方法的 优化和选择合适的底物及筛选条件 , 并建立合适的 宿主载体系统 , 才能加快对新的生物催化剂的挖掘 和利用 ( Ferrer et al , 2005) . 在许多研究中 , 大肠杆 菌被成功地作为宿主进行基 因表达和生物活 性物 质筛选 ( D an ie,l 2005) , 近来 , 其它细菌载体如链霉 菌和假单胞菌也已用于筛选功能克隆子 . 为了便于 聚酮类物质的 异源 表达 , 链霉 菌也就 自然 被作 为 DNA 文库筛选的替代宿主 , 并从重组克隆子中筛选 到一系列 T errag ine 抗生素 . M artinez 等 ( 2005 ) 选用 BAC 穿梭质粒作为

31、载体分别转入到 3 种宿主 , 即大 肠杆菌、变铅青链霉菌 ( S trep tom yces lividans) 、恶臭 假单胞菌 ( P seudom onas putida ). 结果发现 , 这 3 种 宿主在表达编码不同的化学 小分子基因簇的 能力 上各不相同 . 将从环境样品中获得的复制基因 ( rep ) 转入链霉菌菌株 , 结果引起了大量次生代谢产物的 剧增 , 同时也促使了孢子的形成 , 由此说明 , 内含 rep 基因的变铅青链霉菌菌株适 合用作抗生素相 关基 因的异源表达宿主 ( M artinez et al , 2004) . 土壤样 品提取所得的 DNA 中有很大一

32、部分为真核基因组 DNA, 利用细菌宿主往往不利于筛选这部分基因 , 这 也促使了开发真核表达宿主 用于基因文库的 功能 筛选 . 序列 分析法 和功能性筛选 法在土壤微生 物多 样性研究以及新基因挖掘中发挥了重要的作用 , 而 这两种方法各有不足之处 , 为了更全面的挖掘土壤 微生物多样性的组成信息 , 往往需要把这两种方法 结合起来使用 . 如 R ondon 等 ( 2000) 用 BAC 载体构 建了大片段 DNA 插入基因库 , 同时利用序列分析和 活性测定的方法筛选基因库中新的生物活性物质 . 2. 3 底 物 诱导 基 因 表 达 ( SIG EX ) 法 ( Substrate

33、 induced gene expression screen ing m ethod) 序列分析法 和功能性筛选 法在宏基因组 文库 的新基因挖掘中起到了重要的作用 , 但它们存在的 一个共同缺陷就是目标基因的克隆效率较低、操作 费时费力 . 虽然已在 改进方法上作了 很多努力 , 如 利用新的宿主或对含目标基 因的微生物进行 富集 培养 , 但还是无法克服克隆效率低的问题 . 为此 , 一 种新 的 底 物 诱 导 基 因 表 达 法 ( Substrate Induced G ene Expression Screen ing, S IGEX ) 被 用 于 基 因 筛 选 . 代谢相关

34、基因或酶基因往往在有底物存在的条 件下才表达 , 反之则不表达 , SIGEX 即利用这个原理 来筛选目的代谢基因 ( U chiyam a et al. , 2005) . 这个 方法的基本过程主要有 4 步 : 第 1 步是以 p18GFP 为载体构建宏基因组文库 ; 第 2 步是在无底物情况 下以异丙基 D 硫代 半乳糖苷 ( IPTG ) 为 诱导 物去除阴性克隆和绿色荧光蛋白基因 ( gfp ) 表达的 + + 2 期 贺纪正等 : 宏基因组学 (M e tagenom ics)的研究现状和发展趋势 213 克隆子 ; 第 3 步是在培养基中添加底物诱导代谢相 关基因的表达 ; 第

35、4 步是根据 gfp 基因的表达从宏 基因克隆库中筛选出表达代谢基因的克隆子 , 利用 荧光激活细胞分离仪 ( FACS) 从琼脂培养平板上将 GFP 表达的克隆子分 离出来 . 这个方法的优点在于 它为高通量筛选提供了保障 , 而且不需要对底物进 行修饰 . 而不足之处就是 S IGEX 法对目标基因的结 构性和适应性很 敏感 , 同时 , 无法利用 不能进入细 胞质的底物 , 而且 FACS 对进样设备的要求也比较 高 . 然而 , 只要对这些不足之处进行优化 , 选择合适 的条件 , SIGEX 法仍然是一种筛选抗体基因和生物 化合物的有效方法 , 尤其适合于在工业上使用 . 2. 4

36、其它技术 ( O thers) 随着 稳 定 性 同 位 素 标 记 技 术 ( Stab le iso tope probing, SIP )的发展 , 并与分子生物学技术相结合 , 形成了崭新的稳定性同位素探测技术 . 利用该技术 可以不需要常规培养就能将环境中的 微生物与其 功能结合起来 , 加深对不同环境中微生物功能及其 参与的特定生物 地球化学过程 的认识 ( R ada jew ski et al. , 2000) . 从复 杂群落构建的宏基因组文库中 找到特定的目的基因 , 需要筛选和测序成千上万的 克隆 . 通过 SIP 实验使参与特定代谢过程 ( 例如甲烷 氧化 )的生物基因

37、组 富集 , 克 隆从 SIP 实验中获得 的 C 标记的核酸 , 从而构建一个因吸 收了特定的 基质而在环境中执行特定代谢功能的 微生物宏基 因组文库 , 这极大地减少 了需要筛选的 克隆数量 . 如 Lu 和 Conrad( 2005) 利用 CO2作为标记基质对水 稻根际微 生物进 行研究 时 , 先通 过密度 梯度 离心 将 C 标记的 RNA ( 重链 ) 与未 被标记 的 RNA ( 轻 链 ) 分离出并进 行 PCR 扩增 , 构建了含轻 /重 RNA 链的 2 个克隆文库 L rhA 和 H rhA; 通过对文库中基 因序列 的同源性分析发现 , 属于 C luster I 的

38、古菌能 利用水稻根系分泌物为碳源产生甲烷气体 , 对水稻 田温室气体的排放有相当大的贡献 . 除进行 PCR 扩 增后构建文库 外 , 也可将分离出 的 C 标记的核酸 直接用于构建克隆文 库 . 如 D um ont 等 ( 2005) 在一 个验证性实验中 , 从 CH4 标记的森林土壤样品中 提取纯化 C DNA, 用 限制性酶酶切后 插入细菌人 工染色体 ( BAC )载体 , 构建了一个中型的包括 2300 个克隆的宏基因组文库 ; 通过与甲烷单加氧酶基因 ( pm oA ) 杂交对文库进行筛选 , 对其中一个阳性克隆 进行测序 , 得到大小为 15. 2 kb 的片段 , 其中包含

39、一 个完整的微粒型甲烷单加氧酶基因 ( pMMO ) 操纵子 和几个侧翼基因 ( 编码一些在单碳化合物上生长所 必需 的酶的 基因 ). 这表明 , 通 过 SIP 实验 直接 克 隆 C DNA 并在一个较小的克隆文库中获取目的基 因也是可行的 . 荧 光 原 位 杂 交 技 术 ( F luorescent in situ hybrid izat ion, F ISH ) 是核苷 酸探针技术的一个 重要 发展 , 其以已知微生物不同分类级别上种群特异的 DNA 序列或特异的功能基因序列为基础 , 合成荧光 标记的寡聚核苷酸片段作为探针 , 与环境基因组中 的 DNA 分子杂交 , 通过落射

40、荧光显微镜进行定量分 析以检测特异微生物种群的存在与丰度 . 该方法的 特点是可以进行样品的原位杂交 , 应用于环境中特 定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物 跟踪检测 , 是目前在分子微生物生态学领域应用比 较广泛的方法之一 ( H esse lsoe et al , 2001). 为了将 特定微生物细胞的多态性与 放射性物质的吸 收量 联系起来 , 通常将微生物放射技术与荧光原位杂交 基因多态性特异探针和荧光 显微镜联合起来 研究 环境微生物群落 . 结 合显微技术的发 展 , 环境 基因 组学将在基因检测、表达和环境变化上提供更微观 的世 界 用 于 窥 探 微 生 物 群 落

41、的 变 化 ( R iesenfe ld et al , 2004). 3 环 境基 因组学 的应 用及 研究 现状 ( A pplication and advances o f m etagenom ics) 随着近年来研究的深入 , 宏基因组学研究已渗 透到各个研究领域 , 包括海洋、土壤、热液口、热泉、 人体口腔 及胃 肠道 , 并 在医药、替 代能 源、环境 修 复、生物技术、农业、生物防御及伦理学各方面显示 了重要的价值 . 由于 研究涉及领域较 多 , 这里 仅就 水体和土壤环境基因组学进行介绍 . 3. 1 水体宏基因组学 (W ater m etagenom ics) 水体环

42、境基 因组学目前主 要以海洋和极 端环 境为主 , 而 海洋环 境基因 组学 则是研 究的 热点 之 一 . 海洋环境基因组学是功能基因组学 的一个重要 分支 , 主要研究海洋 生物群落的组成 多样性、生理 生化及生态功能 ( F alkow sk i and V argas, 2004). 运 用基因组学的手段研究海洋生态系统 , 不仅可以获 得有关海洋生物生理多样性 和生物功能的详 细信 息 , 还有助 于我们 了解生 物体 是如何 响应 环境 胁 迫的 . V enter 等 ( 2004)收集 Sargasso 海表层水样构建 了宏基因组文库 , 应用鸟枪测序法对基因组文库进 行分析

43、, 得 到了大 量物种 多样 性和丰 度方 面的 信 13 13 13 13 13 13 13 214 10 环 境 科 学 学 报 28 卷 息 , 共测得 1. 05 10 个碱基对 , 发现 6 1 800 多种新 端螺旋体属第 2 组的细菌可固定碳原子、产生生物 的海洋微生物及 1. 21 10 余种科学界从未见过的 基因 , 为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提 供了前所未有的原始素材 . 海洋蕴藏着巨大的生物 多样性和复杂性 , 宏基因组学研究将大大促进人们 对它的认识 . Feder 和 M itche ll O lds( 2003) 建立了 一个海洋微生物基因文库 , 应用

44、DNA 微阵列技术分 析鉴定了微生物的基因表达谱 , 所获得的基因组学 数据与生态学及发育生物学的研究结合起来 , 从基 因组整体水平上全面认识这些 被遗忘的大多数 ! 的生理生化及生态功能 , 得到了大量新的数据 . 近几十 年来 , 海 洋生态 环境 受 到了 很大 的破 坏 , 极大地影响到了海洋生 物的生存 . 利用基因组 学对海洋环境进行抢救性研究是环境 学家所面临 的巨大 机 遇 和 挑 战 , 成 为 环 境 学 研 究 的 新 热 点 ( B eja, 2004) . 通过海洋生物全基因组功能分析信 息 , 可以深入了解有关生物响应海洋环境的调控机 制并将其应用于海洋病害防治中

45、 , 如通过功能基因 组途径筛选出爱德华氏细菌的致病基因 , 这对于研 制防治这种细菌病的药物非常重要 ( Lopez G arc ia, 2004) . 除海洋生境外 , 极端环境水体 ( 如酸性矿水、深 海 ) 由于其苛刻的物理化学条件 , 如高度酸化、寡营 养、缺乏氧气和光照 , 使得其中的微生 物群落也较 为独特 , 因此 , 也是目前的一个研究热点 . 利用环境 基因组学对其开展微生物生物群落结 构及生理代 谢对环境变化响应的研究 , 将促进我们更好地理解 这些极端环境生态系统并对其加以调控和利用 . Tyson 等 ( 2004)对酸性水体生物膜中微生物的 种群结构和代谢进行了研究

46、 . 样品来自一个废弃的 黄铁矿井深处酸性矿水表面的粉红色生物膜 . 这是 一个缺乏氧气和光照的环境 , 滋生着特殊的自养微 生物 , 这些微生物从空气中 固定碳和氮 , 同时分解 矿石获得能量 . 这些微生物的活动造成有害重金属 离子的释放 , 带来了严重的 环境问题 . 研究人员用 鸟枪法对 其基因 组文库 进行 了分 析 , 一 共测 定了 76. 2 M bp 的 DNA 序列 , 拼成了 5 个不同的基因组 , 其 中 有 2 个 分 别 与 钩 端 螺 旋 体 属 II 型 ( L ep tosp irillum group II) 和 F errop lasm a II 型的全基 因组非常接近