PCR技术的原理、操作及应用ppt课件.ppt
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1、PCR技术的原理、操作及应用技术的原理、操作及应用湖南省疾病预防控制中心微生物检验科湖南省疾病预防控制中心微生物检验科 黄一伟黄一伟什么是什么是PCR PCR: Polymerase chain reaction,即聚合酶链反应 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 PCR技术的发展历史技术的发展历史1985 关于PCR 的文章首次由美国科学家Kary Mullis等人在 Science杂志上发表 1989 Science杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶(生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶 )的发现,预示着分子时代的到来。12月Science杂志将PCR和它所
2、使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR技术的原理技术的原理 1遗传物质:细胞核 染色体 DNA(脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成)碱基(A、T、C、G)是按双链螺旋排列的,碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。比如人类体细胞中共有31亿个碱基对,按上述的0.1%的差,人和人之间有3百万个碱基对的差别。 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。PCR技术的原理技术的原理 2PCR反应的
3、基本成分包括7种基本成分:模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子基本反应步骤 :变性-退火-延伸最后通过染料如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出PCR技术的原理技术的原理 31234522557294时间(min)温度()适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2535轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍RT-PCR的原理的原理 相对于PCR,在开始阶段增加步骤:RNA cDNA合成,是单链到双链的过程。实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 1 实时荧光定
4、量PCR技术 (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常用的荧光定量PCR试剂:SYBR Green I Taqman水解探针实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 2基线(Baseline) 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即基线。光阈值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光域值设定在PCR扩增
5、的指数期。CT(Cycle threshold)值 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小,反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表CT值。因此,只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 3 Ct与初始模板的关系 固定循环数后,荧光信号与模板数成正比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系,根据样品
6、的Ct值就可计算出样品中所含的模板量0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRn阈值阈值104103102PCR技术的优点技术的优点优点: 特异 敏感 快速、 简便 易自动化等PCR技术的局限性技术的局限性 为了构建特定引物,使特定DNA序列的选择性扩增,必须有一个庞大的已知序列的数据库。 聚合酶链反应效率差异很大,根据不同的因素需要优化反应条件。 PCR技术扩增产物的长度有限。 PCR技术的注意事项技术的注意事项 防止污染,建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生,特别注意阳性样品的拿放,使用一次性耗材,穿戴手
7、套并经常更换,永远在最后一步才加核酸,液体分装使用等。 引物设计合理 Taq酶扩增错误率较高,大约1/100对碱基/20个循环 镁离子浓度对反应效率的影响 仪器稳定性,升降温速率,管子的密合度等 RT-PCR注意防止RNA降解PCR技术的操作技术的操作 1 以流感病毒的RT-PCR和Real-time RT-PCR检测为例说明PCR技术的操作步骤 主要仪器:PCR仪,Real-time PCR仪,微量移液器,高速冷冻离心机,电泳仪和电泳槽,凝胶电泳观察仪或成像系统,生物安全柜等。PCR技术的操作技术的操作 2 1. 病毒核酸RNA提取 2. RT-PCR反应或者Real-time RT-PCR
8、反应 3. UV紫外灯检测或者电脑上直接读取结果流感病毒核酸提取流感病毒核酸提取 1试验材料 QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit (或QIAGEN公司的QIAmp Viral RNA Mini Kit,操作类似) -巯基乙醇(-mercaptoethanol) 70% 乙醇 无菌及DNA,RNA酶的1.5ml 离心管 10l、20l、200l、1000l加样器和枪头 可调13K微型冷冻离心机 待检流感病毒200l流感病毒核酸提取流感病毒核酸提取 21、取采样液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)200ul加在1.5ml Eppendorf管中2、依次加
9、入350ul RLT液、3.5ul-巯基乙醇和70%的乙醇550ul混匀3、将Rneasy mini spin柱子置于干净的2ml收集管上,将2步骤的混合液600ul吸出加入柱子中,12,000rpm,离心15秒,弃收集管中的离心液4、柱子仍放回收集管上,将2步骤剩余的混合液全部吸到柱子上,12,000rpm,离心15秒,弃离心液5、于柱子中加入700ul Wash Buffer RW1液,12,000rpm,离心15秒6、取一支干净的2ml收集管,将离心后的柱子移到新的收集管上,于柱子中加入500ul Wash Buffer RPE液,12,000rpm,离心15秒 7、弃收集管中的离心液,
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