实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展.doc

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1、第 16 卷第 4 期 2007 年 8 月 中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志 CH INESE JOURNAL OF H ISTOCHEM ISTRY AND CYTOCHEM ISTRY V o l 16 N o. Aug. 2007 4 实时荧光定量 PCR 技术的原理及其应用研究进展 赵焕英 包金风 * (首都医科大学北京神经科学研究所 , 关键词 实时荧光定量 PCR; 北京市神经再生修复重点实验室 , 荧光标记探针 ; DNA 结合染料 教育部神经变性病 重点实验室 , 北京 100069) 中图分类号 Q523 1 文献标识码 A 自 从 1983 年 M u

2、llis 发 明 聚 合 酶 链 式 反 应 10nm ), 报告 基团发 出的荧 光能被 淬灭 基团所 吸 ( po lym erase cha in reaction , PCR ) 以来 , PCR 技术 收 , 并依赖其较高的 S /N 比值 ( 信 噪比 , signal 很快成 为科研、临床 诊断的热点技 术。但是传统 PCR 技术在应用中一是不能准 确定量 , 二是容易 交叉污染 , 产生假阳性。直到近年来荧光共振能量 转 移 ( fluorescence resonance energy transfer , FRET ) 技术用于 PCR 定量后 , 上述问题才得到较 好的解

3、决 。实时荧光定量 PCR ( rea l ti e fluoro genet ic quantitative PCR , FQ PCR ) 是在 PCR 定性 技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在 PCR 反应体系中加入荧光基团 , 利用荧光信号积 累实时监测整个 PCR 进程 , 最后通过标准曲线对 未知模板进行定量分析的方 法。该技术不仅实现了 对 DNA 模板的定量 , 而且具有灵敏度高、特异性 和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、 无污染性、具实时性和准确性等特点 , 目前已广泛 应用于分子生物学研究和医学研究等领域 。 1 实时荧光定量 PCR 技术的概述 1 1

4、荧光共振能量转移原理 1992 年 H iguch i 等 首次 提出了 采用动 态 PCR 方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分 析 , 荧光探针技术是基于标记基团的 FRET 原理而 实现的 , 当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基 团的吸 收光谱重叠 , 且两个基团距离足够近时 , 能 量可以从短波长 (高能量 ) 的荧光基团传递到长波 长 (低能量 ) 的荧光基团 , 相当于短波长荧光基团 释放的荧光被屏蔽 , 这个过程称为 FRET 。在探针 5! 端标记一个报告基团 ( R ) , 在 3! 端标记一个 淬灭基 团 ( quencher, Q ) , 两者 距离 很近 时

5、( 7 收稿日期 2006 10 31 修回日期 2007 01 26 作者简介 赵焕英 , 女 ( 1975), 汉族 , 在读硕士研究生。 * 通讯作者 ( T o whom correspondence shou ld be addressed) to noise ratio) 和良好的辨别能力进行定量检测。 1 2 实时荧光定量 PCR 几个重要参数 荧光域值 ( thresho ld) : 以 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号 , 一般荧光域 值定义为 3- 15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 # C t 值 : 也称 循环阈值 , C 代表 Cy

6、cle, t 代表 threshold 。 C t 值是指样品管的荧光信号达到 某一固定阈值的 PCR 反应循环数。在 PCR 循环过 程中 , 即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的 拐点所对应的循环次数。在实际操作中 , 这个时刻 也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的 时刻 , 可见 C t 值取决于阈值。 R n: 是指模板 DNA 的起始拷贝数 (图 1 所示 )。经数学证明 , Ct 值与模板 DNA 的起始拷贝数 ( Rn ) 成反 比。典 型的 PCR 分 4 给阶段 ( 图 2)。 图 1 实 时荧光定量 PCR 几个重要参数 F ig. 1 The i portant

7、 param eters o f real ti e PCR 图 2 典型的 PCR 分 4 个阶段 F ig. 2 The 4 phases of rea l ti e PCR 1 2 第 4 期 赵焕英等 . 实时荧光定量 PCR 技术的原理及其应用研究进展 493 2 实时荧光 PCR 的分类 实时荧光 PCR 是在扩增产物聚集的过程中连 续检测 , 即 % 实时 & 检测 , 根据在指数扩增期的产 物量来推算初始模板 的拷贝数 。实时荧光定量 PCR 包括探针类和染料类两种 , 探针类是利用与靶 序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。染料 图 3 F ig. 3 T aqM an 探

8、针 T aqM an P robe 类如 SYBR G reen I 则是利用与双链 DNA 小沟结合 发光的理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增 加了探针的识别步骤特异性更高 ; 但后者则简便易 行、成本较低。 2 1 荧光标记探针 按其基团标记和能量转移的方式 , 目前已经开 发出几种相关的技术 , 大体可以分为水解探针和杂 交探 针两 类。如 T aq M anTM 探针 ( 水解 探针 ) 、 T aq m anMG B ( 水解探针 ) ( D ual o ligo FRET pairs ( 双杂 交探 针 ) 、 M o lecu lar beacons ( 杂 交 探针 ) 、

9、 Sco rp ions TM /Am plifluor TM ( 杂 交探针 ) 、 U niver sal probe library LNA ( locked nuc leic ac ids ( 水解探 针 ) 、 Lux ( light upon ex tent ion 杂交探针 ) 、 S i p le proble 探针等 。 2 1 1 T aqM an 探针法 这种探针的长度为 20- 24 bp, 在其 5! 末端标 记一个荧光报告基团 , 3! 末端标记一个荧光淬灭 基团 , 其序列与两引物包含序列内的一段 DNA 模 板完全互补。该法利用 T aq 酶的 5! 3! 外切

10、酶 活性 , 当探针保持完整时 , 淬灭基团吸收发射基团 的发射荧光。当有特异的而不是非特异的 PCR 发 生时 , T aq 酶同时发挥其 5! 3! 外切酶活性 , 将 与模板杂交上的探针切碎 , 报告基团 与淬灭基团分 离 , 淬灭作用被解除 , 荧光信号释放 , 可以检测到。 荧光信号的强度与 PCR 反应产 物的量成 正相关。 在 PCR 反应中设立标 准品模板 系列和阴 性对照 , 根据 FRET 原理 , 探针完整时发射基团发射的荧光 信号被淬灭基团吸收。当 PCR 扩增时 , T aq 酶的 5( 3(外切酶活性将探针 酶切降解 , 使荧光发射基 团和荧光淬灭基团分离 , 从而

11、荧光监测系统可接收 到荧光信号 , 即每扩增一条 DNA 链 , 就有一个游 离的 荧光 分 子形 成 , 实 现了 荧 光 信号 的 累 积与 PCR 产物形 成完全同 步 , 并计 算出 R n 值、 ) R n 值、 C t 值和阈值。同时利用标准品模板系列绘制 出标准曲线 , 结合各样品的 C t 值 , 就可以确定样 品的起初模板量。常用的荧光基团是 FAM、 TET、 V IC、 HEX ( 图 3) 。 2 1 2 T aq m an MGB T aqm an MGB 探针是 T aqm an 探针的基 础上改 进的 , 在探针的 3! 端增加了 MG B ( m inor gr

12、oove b inder) 分 子 , 这种物质 能够结合在双 链 DNA 小 沟部位 ; MG B 提高了探针的 TM 值 , 从而使它能 够分辨 1 个碱基的差别 : 完全配对 , 有荧光信号 ; 一个碱基不匹配 , 则没有信号 ; 而且连在 MGB 分 子后的是非荧光物质的淬灭基团 , 因此使这种探针 具备更好的淬 灭效果且无背景 荧光、荧光 标记灵 活、提高荧光信号的信噪比、提高退火温度、探针 短、提高 SNP 识别率等优点。从而具 备了更加广 泛的应用前景 (图 4) 。 图 4 T aqM an M GB 探针 F ig. 4 T aqM an M GB probe 2 1 3 双

13、杂交探针 双杂交探针是 R oche 公司新近开发的一种 PCR 定量技术 , 也是依赖于 FRET 原理进行的。该技术 的特点是将荧光基团和淬灭基团分别标记在发光探 针的 5( 和淬灭探针的 3(端两个不同的探 针 , 两 探针可与模板同一条链相邻的序列杂交 , 杂交时两 探针的荧光基团和淬灭基团便紧密相邻 ( 1 - 5 个 碱基 ) , 从而发生 FRET 而使荧光淬灭 , 荧光淬灭 的程 度 与 起始 模 板的 量 成 反比 , 以 此 可以 进 行 PCR 定量分析。该方法的特点 是淬灭效率高 , 但 由于两个探针结合于模板上 , 因此影响扩增效率 ; 此外 , 由于需要合成两个较长

14、的探针 , 合成成本相 对较 高 , 常 用 的 荧 光 基 团 是 LC R ed640 和 LC R ed705 (图 5) 。 图 5 双杂交探针 F ig 5 Tw o hybrid probe 3 4 494 2 1 4 分子信标 中国组织化学与细胞化学杂志 上荧光报告基 团 和淬灭基团 ; 第 16 卷 LNA 单体掺 入寡核 分子信 标 ( m olecular beacon ) 技 术是一 种呈 苷序列可以增加形成体的 Tm 值 , 其稳定性比 PNA 发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针 , 环形部分的 高 ( PNA S2000, 97: 5633 5638) 因 LNA 与

15、DNA 碱基可与目标核苷酸序列互补 , 一般为 15- 30 个 杂交 较 DNA 与 DNA、 DNA 与 RNA 甚至 PNA 与 核苷酸长 ; 茎部是由互相配对的碱基组成 , 不能与 DNA 杂交有更高的亲和性 , 故这种探针稳定性最 目标基因相配对结合 , 一般 5- 7 个核苷酸长 ; 在 好 ; 而且探针实现了设计迅速简单、低成本的水解 3(和 5(端分别接上发光基团和淬灭基团 , 当溶液中 探针特点。一 般上其公司网 站后 , 输入基 因序列 有特异模板时分子信标与模板杂交 , 从而破坏了发 号 , 就能订制 , 无需检测引物二聚体和非特异性片 卡结构即实现了 FRET , 释放

16、出荧光信号 , 荧光的 段。因此 LNA 技术实现了高熔点和高特异性结合 强度与溶液中分子信标的量成正比 , 从而实现了对 特点 ; 可以用于所有的荧光定量 PCR 仪 ( 图 7)。 目的基因的定量 检测。当 PCR 扩增过程中 , 靶序 列 DNA 链不断增加 , 探针与之杂交 , 探针的发夹形 结构被打开 , 呈线性 , 荧光报告基团与淬灭基团彼 此在空间上产生足够的分离 , 荧光基团脱离了淬灭 基团的影响 , 从而产生可被检测到的荧光 ( 图 6) 。 常用的荧光基团有 FAM 和 T exas R ed。 图 7 F ig 7 LNA 结构 LNA structure 图 6 分子信

17、标 LUX 2 1 7 LU X 引物 ( light upon ex tent ion, LU X ) 引物运用高 F ig 6 M o lecular beacon 灵敏度的荧光检测系统实时监控每个循环 ; 并利用 2 1 5 Am plisensor 检测系统 累积荧光强度 , 通过确立 C t 值的方法确立样品起 , 是由美国 B iotrn ics T ech 公司推出的荧光定量 PCR 检测系统 , 其基 本原理是先进行一次不对称 扩增 ; 第二轮扩增时 , 在双链信号引物的两条互补 链上 , 分别标记荧光供体和受体 , 当信号引物处于 双链结构时 产生 荧光。在 PCR 过程中

18、, 变性使引 物荧光基团分离 , 复性时引物将优先与不对称扩增 产物结合 , 使引物不再产生荧光。 Am p lisensor 检测 系统采用半套式扩增和双链引物 , 特异性高 , 灵敏 度与竞争性 PCR 相似。 2 1 6 U niversal probe library LNA ( locked nu cle ic A cids) 新近 R oche 公司研发并建立了人类和鼠的通用 探针库 , 其探针是由 % 锁定核 酸 & 组 成。他们通 过分析人的转录组识中所有不同 的可能的 8 至 9碱 基序列 , 按照他们在转录组中出现的频率分类 , 找 出最普便的 8 至 9 碱基序列模式制备

19、成通用探针 ; 每一个探针可以与 7000 个转录子杂交。这种探针 的特异性由探针和引物共同实 现。 LNA 是一种双 RNA 聚合的类 似物 , 其 2 位 的氧原子与核 糖 4 碳原子形成亚甲基的桥键 , 并分别在 5 和 3 标记 使引物始模板数从而实现定量。使用 LUX 引物不 需要专门设计探针即节省了成本又给实验设计提供 了宽松的条件。由于没有探针控制特异性 , 因此它 的特异性要弱于 探针技术 , 但不受非特异性扩增或 引物二聚体影 响 , 所以其特 异性和灵敏度 均较高 ( 图 8)。 图 8 Lux 工作原理 F ig 8 T he function m echan ism o

20、 f Lux 2 1 8 S i ple 探针 最近 Roche 公司生产一种简单探针 , 这种探针 只在 5! 端标有报告荧光 , 在报告荧光和 5! 端之 间连接一种称作 % linker& 的结构 , 只有在变性阶 段 , 探针与目标 序列互补 结合时 , 引起 % linker& 结构发生改 变 , 从而报告荧 光基团的荧光 得以显 现。这种探针的好处是不用淬灭基团 , 从而无背景 荧光 (图 9) 。 第 4 期 赵焕英等 . 实时荧光定量 PCR 技术的原理及其应用研究进展 在实时荧光 PCR 中 , 495 模板的定量有两种方法 : 图 9 F ig. 9 S i p le 探针

21、 Si ple P robe 绝对定量和相对定量。绝对定量指用已知的 标准曲 线来推算未知的样本量 ; 相对定量指在一定样品中 靶序列相对于另一参照序列的量的变化。由于每个 模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线 性关系 , 利用已知起始 DNA 浓度的标准品可做出 标准曲线。 2 2 双链 DNA ( dsDNA ) 结合染料 3 1绝对定量 目前用于实时 PCR 的 dsDNA 结合染料 , 5 主要 绝对定量 FQ PCR 一般采用外标准品定量的制 有 SYBR G reen I 和 LC G reen TM I 2 2 1 SYBR G reen I 。 备来实现绝对定量 ,

22、 可以通过化学合成目的基因 ; 是一 种非饱和菁 类荧光素 , 可以 嵌合于 DNA 或是将 PCR 扩增产物直接梯度稀释 ; 产物克隆到载体上 , 然后抽提出质粒 , 或是将 PCR 经过测量浓 双链结构的小沟中。其处于游离状态时 , 检测不到 度和拷 贝 数 可 准 确 定 量 , 6 它 的 优 点 是 稳 定、准 荧光信号 , 当结合 dsDNA 后荧光强度明显增强 , 即 确 。质粒 DNA 和体外转录的 RNA 常作为绝对定 被荧光探测系统检测到 , 荧光强度的增加与初始模 量的标准品。将标准品稀释成不同浓度的样品 , 并 板量相关 , 可以进行定量 DNA 分析 , 已有应用于临

23、 作为模板进行 PCR 反应。以标准品拷贝数的对数 床诊断和科学研究中的报道。 SY BR G reen 染料法 与探针法相比 , 其优势在于检测方法简便 , 同时降 值为横坐标 , 以测得的 C t 值为纵坐标 , 绘制标准 曲 低了检测 成本。但 是 , 由于该 染料能够 结合任何 线。对未知样品进行 定量时 , 根据未知 样品的 Ct dsDNA 分子 , 因此不能保证 PCR 的特异性。可以 值 , 即可在标准曲线中定出样品的拷贝数。做好标 通过优 化 PCR 的反应条件 , 减少或去除非特异性 准曲线至关重要 , 对于 RNA 样品 , 标准品最好是 产物和引物二聚体的产生 , 另外

24、 , 也可以借助融解 体外转录的 RNA , 如果用 cDNA 、 PCR 产物作为 曲线分析法来区分非特异性产物和引物二聚体而进 标准品 , 虽然制备简单易于保存 , 但是将会因为标 行定性诊断 (图 10) 。 准品无法准确指示样品反转录效率 , 而给最终定量 图 10 F ig 10 SY BR green SYBR G reen I 起始拷贝数带 来影响。绝对 定量也具有相 应的缺 陷 , 标准品的稳定保存很难获得成功。目前广泛使 用的在 260 nm 波长下定量的方法与众多因素有关 , 如水、缓冲液、仪器性能 , 乃至于核酸的抽提过程 都会影响到结果的稳定性。 3 2 相对定量 相对

25、定量是指在测定目的基因的同时测定某一 内源性管家基因 , 该管家基因主要是用于核苷酸的 拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在 PCR 扩 2 2 2 LC G reen TM I 增的影响因素 , 通常选用的管家基因 有 GA PDH 、 是最新出现 的一种 dsDNA 结合染料 , 与 SYBR 2 微球蛋白和 rRNA 7 。使用的 actin、相对定 G reen I 相比 , 该染料是一种饱和结合染料 , 能够完 量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲 全结合 dsDNA 分子 , 可直接加入 PCR 反应体系中 , 线 , 根据该标准曲线得到目 的基因和管家 基因的 高浓度的

26、LC G reen TM I 不会抑制 PCR 反应。已有 文献报道在 PCR 反应体系中加入 LC G reen TM , 使 量 , 再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最 用一对引物 , 一个不作标记的探针 , 结合常规融解 后结果。此种方法计算出未知样品的量是相对于某 个参照物的 量而言 , 因此 , 相对定 量的标准曲线 比 曲线或仅使用一对引物 , 曲线的形状和融解温度 PCR 结束后通过分析融解 ( Tm 值 ) 的大小 , 对纯合 较容易制备 , 对于所用的标准品只需知道其稀释度 子和杂合子以及寡核苷酸序列多态性 ( SN P ) 进行 即可。在整个试验中 , 待测样品的量来

27、自于标准曲 鉴别。 LC G reen TM I 染料法 简便、快速、精确性 线 , 最终必须除以参照基因的量 , 即参照基因是 1 高 , 预期将会有很好的应用前景。 +的样本 , 其他的样本为参照基因的 n 倍。由于管 3 实时荧光 PCR 的定量方法 家基因在各种组织中的恒定表达 , 所以可用管家基 496 中国组织化学与细胞化学杂志 第 16 卷 因的量来作为标准 , 以比较来源不同的样本 , 目的 有不同的荧光报告基团标记的探针分别与野生 基因表达量 的差异 , 此即相对定量。这一方法的缺 型和突变基因杂交 , 探针杂交的效率和其后的切除 陷是要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一

28、 致 ; 此外加入已知起始拷贝数的内标相当于是进行 双重 PCR 反 应 , 存在 两种 模板 相互 的干 扰 和竞 争 。 3 3 比较 C t 值法 即 CT 值法 , 该方法是同时扩增待测靶基因 片段和一个作为内参 照的基因片段 , 一般是一个内 源性管家基因片段。这两个扩增反应可在 2 管中分 别进行 , 也可在同一反应管中进行 , 测得两者的 CT 值之差 , 即 CT 。该方 法不需要标准曲线。它是 根据 PCR 扩增反应的原理 , 假设每个循环增加倍 的产物数量 PCR 反应的指数期得到扩增产物的值 来反映起始模板的量通过数学公式来计算相对量。 比较 Ct 法与标准曲线法的相对定

29、量的不同之处在 于其运用了数学公式来计算相对量 , 前提是假设每 个循环增加一倍的产物数量 , 在 PCR 反应的指数 期得到 C t 值来 反应起始模板的量 , 一个循环 ( C t = 1) 的不同相当于起始模板数 2 倍的差异。比较 不同待测标本 DNA 的 CT 值与正常标本 DNA 的 CT 值的变化 , 即可对未知标本靶基因的原始拷贝 数作出判断 , 从而对病理状态进行判断或诊断。但 是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本 一致为前提的 , 效率的偏移将影响实际拷贝数的估 计 。最终结果也是靶序列和参考品的相对比值。 该方法需确定靶序列和参考品的扩 增效率是否一 致 ; 如不

30、一致 , 则会影响结果的准确性。 4 实时荧光 PCR 技术的应用 实时荧光 PCR 技术已广泛应用于临床及生命 科学研究的各个领域中。在科研方面可定量分析各 种基因的表达分析 , 基因突变和多态性分析 , 单核 苷酸多态 SN P 测定及易位基因的检测 ; 在医疗方 面可用于免疫组化分析、临床疾病早期诊断、病原 体检测、 耐药 性 分 析、肿 瘤 微 小 残 留 病 变研 究 等 。以下就其在基因工程研究、病原体的检测 和肿瘤分子诊断等方面的应用及其 新进展作一简 述。 4 1 基因工程研究领域 实时荧光定量技术的出现不仅加强了有关对基 因的量的研 究方法 , 而且也加强了对基因的质所发 生

31、变化的研究。它可以检测基因突变和基因组的不 稳定性 , 已经被广泛应用于遗传分析 。 4 1 1 基因表达研究 与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另 一种 , 说明它是一个纯合子 , 如果荧光信号都增加 则表明是 一个杂合子。刘敬忠等报道 使用 dsDNA 结合染料 SY BR G reen I, 结合融解曲线分析对 地 中海贫血纯合子、杂合子作出诊断 。使用双 色 荧光标记探针 , 结合不同的引物设计 , 可以实现对 某些先天性疾 病的定量检测。应用实时荧 光定量 PCR 方法对 地中海贫血症 ( 地贫 ) 患者 与 ! 珠蛋白 mRNA 水平进 行检 测 , 其结 果特 异性 强、

32、 定量准确 , 为了解 地贫的分子 病理机制及其临 床诊断提供了可靠的检测数据。迄今对遗传性物质 改变引起的疾病还无法根治 , 只能通过产前监测和 产前基因诊断 , 减少病婴出生 。因此 , 实时荧 光定量 PCR 方法可用于产前监测和产前基因诊断。 4 1 2 单核 苷酸多态性 ( SN P) 及突变分析 实时荧光定量 PCR 一个诱人的应用前景是用 于检测基因突变和基因组的不稳定性 。基因突 变的检测基于两条探针 , 一条探针横跨突变位点 , 另一条为锚定探针 , 与无突变位点的靶序列杂交。 两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中 无突变 , 探针杂交便完全配对 , 如有突变 , 则

33、探针 与靶序列不完全配对 , 会降低杂交体的稳定性 , 从 而降低其熔解温度 ( Tm ) 。这样便可对突变和多 态性进行分析。 4 1 3 转基因研究 T esson 等 确 定了实 时定量 PCR 的 技术条 件 , 利用两种发光探针及适当的循环域值 , 扩增一个转 移后的基因和一个对照基因 , 以分析转基因鼠的接 合性 。同型结合的和异质接合 的动物交配后其 子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律 , 通 过实时定量 PCR 检测 , 该方法为 转基因动物的同 型结合及异质接合提供了明确的鉴定结果。这项技 术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将 有很大用途。 4 2 肿瘤的分子诊

34、断 肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化 , 是一种 多基因异常的疾病 , 这些异常变化用实 时荧光定量 PCR 方法都 可以检测出来。目前用此方 法进行过 端粒酶 hTERT 基因、慢性粒细胞性白血 病 ER 基 因、肿瘤 MDR1 基因等 , 尽 管肿瘤发病的 分子机 制尚未完全阐明 , 但相关基因的遗传学改变的积累 是致癌性转变的根本原因之一已得到普遍承认 。 8 9 10 11 第 4 期 赵焕英等 . 实时荧光定量 PCR 技术的原理及其应用研究进展 pr i e rs for rea l ti e PCR 497 Am er ican B iotechno logy L abo 癌基因

35、的突变和表 达增加 , 在 许多肿瘤 早期就出 ra to ry, 2003, ( 7) : 52 56 现。实时荧光 PCR 技术不仅能有效地检测到基因 5 Wittwer CT, R eed GH, G undry CN, et a l H igh reso lution 的突变 , 而且可以准确检测癌基因的表达量。如定 geno typ ing by am plicon m e lting analysis us ing LC G reen C lin Chem, 2003, 49 ( 6 pt 1): 853 860 量结直肠癌淋巴 结的癌胚 抗原 ( CEA ) mRNA 的 17

36、6 Z i m erm ann B, H olzg reve W, W enze l F, et a l N ove l re 表达量 , 可作为 诊断癌 症微转 移的 重要 依据 。 a l ti e quantitative PCR test for tr isom y C lin Chem, 目前 , 肿瘤患者的生存期已有所延长 , 但是缓解期 2002, 48 ( 2): 362 363 7 G a lbiati S, Sm id M, G am b ini D, et al F eta l DNA detec 的患者仍存在复发的危险 , 因此 , 微小残留病变的 tion in m

37、aterna l plasm a throughout gestation 2005, 117 ( 2 3): 243 248 Hum G enet 检测对于进一 步调整治疗方案至关重要。实时荧光 8 RobertM W , Ste lla L , M ichae lG , e t a l M easurem ent PCR 技术正成 为检测肿瘤微小残留分子标志的一 o f Epste in barr v irus DNA loads in who le blood and plasm a 种必备工具 18 。 Eckert 等 提出采用实时荧光 PCR by T aq M an PCR co

38、mpetitive PCR 5249 and in per iphera l blood lym phocytes by J C lin M icrob io,l 2003, 41 : 5245 技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微残留病灶 , 儿童急性白血病的治疗有重要指导意义。 对 9 M agnus L , CharlesH D ynam ic range and reproduc ib ility 4 3 病原体的分子检测 o f hepatitis B v irus ( HBV ) DNA detection and quantifica tion by cobasT aqm anH B

39、V, a rea l ti e sem iautom ated as say J C lin M icrob io,l 2005, 43 : 4251 4254 目前 , 用此方法还进行了对人类结核杆菌、免 10 Natha lie D, A xe lle D, V ronique S , et al Q uantifica 疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨细胞病毒、 EB 病毒等 病原体 的检 测 。同样 在国 内 , 2004 年针对 Sars 流 行性病的检测和诊断使得荧光定量 PCR 技术得以应用和发展。荧光定量 PCR 问世后 的几年中 , 积累了大量有关病原体核酸量与感染性 疾病

40、发生、发展和预后 之间关系的资料 , 这些研究 资料不断丰富 , 将形成感染性疾病的临床分子诊断 标准。目前 , 实时 荧光 PCR 技术 已应 用于 肝病、 性病以及人类免疫缺陷病毒 ( H IV ) 等各种病原体 的临床诊断 , 为实现快速准确诊断提供了有效的检 测方法。 5 小结 通过设计针对目的基因的特异性引物和探针 , 并优化反应体系和反应循环参数 , 已成功地建立了 快速、灵敏、特异的 FQ PCR 检测方法。可实现大 量样本同时检测 , 并 节省大量试验 时间和反应成 本 , 为基因定量检测和准确定量疾病相关基 因的表 达提供了有效的技术手段 ; 同时实现对人类和动物 疾病的早期

41、诊断与基因分期、分型 , 以及对人类肿 瘤转移 的早期发 现及预 后判 断 。因此 FQ PCR 技术将成为未来分子生物学实验室 必备的研究工 具 , 在临床上将有更加广阔的应用前景。 参 考 文 献 1 C legg RM F luorescence resonance energy transfer Curr Op in B iotechno , 1995, 6 ( 1): 103 110 2 M ikae lKA, Jose M A, M artin B, e t al T he real ti e po ly m erase cha in reaction M o lecular A

42、spec ts of M edic ine, 2006, 27: 95 125 3 Jones C D , Y eung C, Zehnde r J L , et al Comprehens ive validation o f a rea l ti e quantitative PCR assay fo r c linical labo ra to ry use J C lin P atho , 2003, 120 ( 1): 42 48 4 W olfgang K , Jonathan N , K aras S , e t al F luorogenic tion ofH um an i

43、munodeficiency v irus type 1 prov iral load by a T aqM an real ti e PCR assay J C lin M icrob io , 2001 , 39 : 1303 1310 11 Hw a HL, K o TM, Y en M L, e t a l F eta l gender de term i nation using real ti e quantitative po lyme rase cha in reac tion analysis o f m ate rna l plasm a J Formos M ed A s

44、 soc, 2004, 103 ( 5) : 364 368 12 刘敬忠 , 闫梅 , 王立荣 , 等 实时荧光 聚合酶 链反应 结合融解曲线分析 在 地中 海贫 血基 因诊 断中 的价 值 中华检验医学杂志 , 2005, 28 ( 8): 858 861 13 U eno H , Y oshida K , H ira i T Q uantita tive detection of carcinoem bryon ic antigen m essenger RNA in the perito nea l cav ity of gastr ic cancer patients by rea

45、l ti e quanti ta tive reverse transcr iption po lyme rase chain reaction Anticancer R es, 2003 , 23 ( 2C) : 1701 1708 14 N ieuw enhu is E J , Jaspa rs L H , Castelijns J A , et al Quantitative mo lecu lar detection o f m in i a l residua l head and neck cancer in lymph node asp ira tes C lin Cancer R es, 2003 , 9 ( 2) : 755 761 15 L iew M, P ryo r R, P ala is R, et a l G eno typ ing o f sing le nucleotide po lym orphis