高效液相色谱法ppt课件.pptx

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1、高效液相色谱高效液相色谱法法第一节第一节 概述概述一一、起源、起源俄国科学家：俄国科学家：M. S. M. S. TswettTswett 1903 1903年发明，年发明，19061906年正式命名色谱法年正式命名色谱法。2020世纪世纪3030年代开始广泛研究和年代开始广泛研究和应用应用色谱按流动相的物态分色谱按流动相的物态分: :气相色谱和液相色气相色谱和液相色谱谱 色谱法的简称色谱法的简称( (又叫色层法又叫色层法, ,层析法层析法),),其本质是一种分离分析方法其本质是一种分离分析方法 常见的分离常见的分离方法方法 蒸馏蒸馏 离心离心 电泳电泳 过滤过滤 色谱：目前最有效的分离方法色

2、谱：目前最有效的分离方法以高压液体为流动相的液相色谱分以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（析法称高效液相色谱法（HPLC)HPLC)。色谱泵进样器检测器数据处理色谱柱HPLCHPLC是是在经典色谱理论的基础上，在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、高灵敏检测器等新采用了高压泵、高灵敏检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析实验技术建立的一种液相色谱分析法法。它是它是2020世纪世纪7070年代初发展起来的一年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术种新的色谱分离分析技术。液液相色相色谱的分类谱的分类1. 1. 按按流动相和固定相的相对极性分流动相和固定相的相对极性分: :正相色正

3、相色谱：固定相谱：固定相的极性大于的极性大于流动相流动相反相反相色色谱：固定相谱：固定相的极性小于流动相的极性小于流动相2.2.按分离过程的机理分按分离过程的机理分: :吸附色吸附色谱谱分分配色配色谱谱离子交换色谱离子交换色谱, ,简称离子色谱简称离子色谱(IC)(IC)体积排除色体积排除色谱谱超高效液相超高效液相色谱（色谱（ UPLC UPLC ）：）：是区别于是区别于HPLCHPLC的液相色谱新领域的液相色谱新领域基于基于小颗粒填料和小颗粒填料和LCLC原理的一种创新方法原理的一种创新方法实现超高分离度、灵敏度、分析实现超高分离度、灵敏度、分析速度速度与传统的与传统的HPLCHPLC相比，

4、相比，UPLCUPLC的速度、灵敏度的速度、灵敏度及分离度分别是及分离度分别是HPLCHPLC的的9 9倍、倍、3 3倍及倍及1.71.7倍。倍。是是WatersWaters公司对液相色谱的新贡献公司对液相色谱的新贡献(2004(2004年年3 3月正式推出月正式推出) )二、二、HPLCHPLC与与GCGC区别区别相同相同：兼具分离和分析功能，均可：兼具分离和分析功能，均可以在线检测以在线检测主要主要差别：分析对象、流动相、操差别：分析对象、流动相、操作条件作条件上上分析分析对象对象GCGC：能气化、热稳定性好、且沸点：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、较低的样品，高沸

5、点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，占有机物的品不可检测，占有机物的20%20%HPLCHPLC：适于分析气相色谱法不能分：适于分析气相色谱法不能分析的分子量较大、难气化、不易挥析的分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有物及高聚物的分离分析，大约占有机物的机物的707080%80%。流动相流动相差别差别GCGC：流动相为惰性气体，组分与流：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作动相无亲合作用力，只与固定相作用用HPLCHPLC：流动相为液体，流动相与

6、组：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力分间有亲合作用力，对，对分离起很大分离起很大作用作用操作操作条件差别条件差别GCGC：一般都在较高的温度下进行分：一般都在较高的温度下进行分离分析离分析HPLCHPLC：通常在室温条件下操作；高：通常在室温条件下操作；高压（压（15-35 15-35 MpaMpa。）。三、三、HPLCHPLC与经典与经典LCLC区别区别相同：高效液相色谱的原理与经典相同：高效液相色谱的原理与经典液相色谱相同液相色谱相同主要区别：固定相差别，输液设备主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段和检测手段。固定相差别固定相差别经典经典LCLC：固定相：固定相粒径粒径1001

7、00m m且不且不均匀均匀；HPLCHPLC：固定相：固定相粒径粒径1010m m（球形，（球形，匀浆装柱匀浆装柱）输液输液设备设备经典经典LCLC：常压：常压输送流动相，柱效低输送流动相，柱效低（H H，n n），分析分析周期长周期长；HPLCHPLC：高压：高压输送流动相；柱效高（输送流动相；柱效高（H H，n n）；分析时间大大）；分析时间大大缩短缩短检测手段检测手段经典经典LCLC：无法：无法在线在线检测检测HPLCHPLC：可以：可以在线检测在线检测四、四、HPLCHPLC的特点和应用的特点和应用1 1高柱高柱效效2 2高高灵敏度灵敏度3 3高高选择性选择性4 4分析速度分析速度快快

8、5 5应用范围应用范围广泛广泛五、五、HPLCHPLC的固定相和流动相的固定相和流动相简介简介（一）、固定相（一）、固定相以以承受高压能力来承受高压能力来分两分两大大类类刚性刚性固体固体：以二氧化硅以二氧化硅（硅胶硅胶）为为基质基质，可承受，可承受7.07.0 10108 81.01.0 10109 9PaPa的高压的高压，它它是目前最广泛使用的一种固定相。是目前最广泛使用的一种固定相。硬硬胶胶：主要主要用于离子交换和尺寸排阻色用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为而成。可承受压力上限为3.53.5 10108 8Pa

9、Pa。（二）、流动相（二）、流动相1. 1. 分类分类按按组成不同可分为单组分和多组成不同可分为单组分和多组分组分按按极性可分为极性、弱极性、非极性可分为极性、弱极性、非极极性性按按使用方式有固定使用方式有固定组成组成（等梯度）（等梯度）淋洗和淋洗和梯度淋洗梯度淋洗。2. 2. 常用溶剂常用溶剂己己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙醇、乙腈、乙腈、甲醇、甲醇、水。、水。常用流动相极性常用流动相极性石油醚汽油庚烷己烷二硫化碳石油醚汽油庚烷己烷二硫化碳二甲苯甲苯氯丙烷苯溴乙烷二甲苯甲苯氯丙烷苯溴乙烷溴化苯二氯乙烷三氯甲烷异丙醚溴化苯二氯乙烷三氯甲烷异丙醚硝基甲烷乙酸

10、丁酯乙醚乙酸乙酯硝基甲烷乙酸丁酯乙醚乙酸乙酯正戊烷正丁醇苯酚甲乙醇叔丁醇正戊烷正丁醇苯酚甲乙醇叔丁醇四氢呋喃四氢呋喃(THF)(THF)二氧六环丙酮乙二氧六环丙酮乙醇乙腈醇乙腈异丙醇异丙醇甲醇甲醇氮氮二甲基甲氮氮二甲基甲酰胺水酰胺水 第二第二节节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪自高效液相色谱仪自19671967年问世以来年问世以来，基本，基本结构和工作结构和工作流程流程都差不多。都差不多。 典型的典型的高效液相色谱仪高效液相色谱仪是是由五由五个基个基本部分和相关辅助部件构成本部分和相关辅助部件构成。 高压高压输液输液系统系统 进进样样系统系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 色

11、色谱数据处理系统（色谱工作站）谱数据处理系统（色谱工作站）一、一、高压输液高压输液系统系统（一）贮液罐一）贮液罐现多数使用溶剂瓶，一般采用耐腐现多数使用溶剂瓶，一般采用耐腐蚀的玻璃瓶或聚四氟乙烯瓶蚀的玻璃瓶或聚四氟乙烯瓶，容量容量为为1 1到到2 L2 L。贮液罐的放置位置要高于泵体。贮液罐的放置位置要高于泵体。（二）（二）高压输液泵高压输液泵气相色谱由高压钢瓶直接提供动力气相色谱由高压钢瓶直接提供动力，高压输液泵是高效液相色谱仪中，高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一关键部件之一。高压输液泵的高压输液泵的类型类型高压输液泵主要有恒压泵和恒流泵两类高压输液泵主要有恒压泵和恒流泵两类，常使用

12、恒流泵。，常使用恒流泵。恒流泵恒流泵有几种类型，其中往复柱塞有几种类型，其中往复柱塞泵目前应用较多。泵目前应用较多。（三）（三） 输液系统的辅助装置输液系统的辅助装置1 1过滤器：除掉机械杂质及固体过滤器：除掉机械杂质及固体颗粒。颗粒。一般一般用用0.450.45或或0.20.2m m微孔滤膜微孔滤膜（分（分有机相和水相滤膜）进行过滤。有机相和水相滤膜）进行过滤。2 2混合器：体积不宜大。混合器：体积不宜大。3 3脉动阻尼器：种类多，都有一脉动阻尼器：种类多，都有一定容积和弹性。定容积和弹性。4 4压力测量装置：电子压力控制压力测量装置：电子压力控制器流量器流量5 5流量测量装置：电子流量测量

13、装置：电子流量计流量计6 6脱气装置：除掉溶于流动相中脱气装置：除掉溶于流动相中的各类气体，以保证柱效能的各类气体，以保证柱效能。吹氦脱气法。吹氦脱气法。这种脱气方法虽然好，但氦气价格这种脱气方法虽然好，但氦气价格较高，很少使用。较高，很少使用。加热回流法。加热回流法。此法的脱气效果较好。在操作时要此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变会丢失，混合流动相的比例会有变化化。抽抽真空脱气法。真空脱气法。此法可使用真空泵，降压至此法可使用真空泵，降压至0.050.050.07MPa 0.07MPa ，即可除去溶解的气体

14、。，即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析单分析。超声波超声波脱气法。脱气法。将欲脱气的流动相置于超声波清洗将欲脱气的流动相置于超声波清洗机中，用超声波震荡机中，用超声波震荡101020min20min。此。此法的脱气效果最差。法的脱气效果最差。在线脱气在线脱气法法HPLC HPLC 仪器可配在线脱气机。在线仪器可配在线脱气机。在线脱气使用简单，低故障，有效。脱气使用简单，低故障，有效。（四）梯度洗脱装置（四）梯度洗脱装置梯度洗

15、脱梯度洗脱的的目的目的：提高提高分离效果，缩短分析分离效果，缩短分析时间。时间。适适用用于于分析极性差别较大的复杂组分析极性差别较大的复杂组分类似分类似GCGC的程序升温（沸程较长样的程序升温（沸程较长样品）品）梯度洗脱装置分为两类梯度洗脱装置分为两类：1 1外梯度装置（又称低压梯度）外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高，流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。2 2内梯度装置（又称高压梯度）内梯度装置（又称高压梯度），先将两种溶剂分别用泵增压后，先将两种溶剂分别用泵增压后，再由泵按程序压入混合室，混合，再由泵按程序压入混合

16、室，混合，再注入色谱柱。再注入色谱柱。二、二、进进样系统样系统进样系统包括进样口、注射器和进进样系统包括进样口、注射器和进样阀等。样阀等。HPLCHPLC进样方式可分为：隔膜进样、进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。停流进样、阀进样、自动进样。 （一一）阀进样阀进样六通阀进六通阀进样样一般一般高效液相色谱手动进样通常使高效液相色谱手动进样通常使用耐高压的六通阀进样装置。用耐高压的六通阀进样装置。 六通阀的进样方式有部分装液法和六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种完全装液法两种。 完全完全装液装液法进法进样样量准确，重复性好（量准确，重复性好（0.5%0.5%）用部分装

17、液法进样时，进样量应用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的不大于定量环体积的50%50%（最多（最多7575）。用完全装液法进样时，进样量应用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的不小于定量环体积的510510倍（最少倍（最少3 3倍。倍。（二二）自动进样自动进样用于大量样品的常规分析。用于大量样品的常规分析。三、三、分离分离系统系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。接管等部件。( (一一) ) 色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱是液相色谱的心脏是液相色谱的心脏部件部件, ,多多为直为直形。形。色谱柱可分为分析柱；制色谱柱可分为分析柱；制备柱；分析柱的

18、保护柱。备柱；分析柱的保护柱。1 1柱材料及规格柱材料及规格包括包括柱管与固定相两部分。柱管材柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属光滑的聚合材料的其他金属。玻璃玻璃管耐压有限，故金属管用得较管耐压有限，故金属管用得较多多，它，它是由内部抛光的不锈钢管制是由内部抛光的不锈钢管制成成。一般一般色谱柱长色谱柱长5 540cm40cm，内径为，内径为1 16 mm6 mm。凝胶色谱凝胶色谱柱内径柱内径3 312mm12mm。制备柱。制备柱内径较大，可达内径较大，可达25mm 25mm 以上。以上。2 2保护柱保护柱一般在分离柱前

19、有一个前置柱，前一般在分离柱前有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱一样，安装置柱内填充物和分离柱一样，安装在分析柱前在分析柱前。其其作用是收集、阻断来自进样器的作用是收集、阻断来自进样器的机械和化学杂质，以保护和延长分机械和化学杂质，以保护和延长分析柱的使用寿命析柱的使用寿命。选择选择保护柱的原则是在满足分离要保护柱的原则是在满足分离要求的前提下，尽可能选择对分离样求的前提下，尽可能选择对分离样品保留低的短保护柱品保留低的短保护柱。一般用一般用1cm1cm长的长的保护柱保护柱即可即可保护柱也可装填和分析柱不同的填保护柱也可装填和分析柱不同的填料，如较粗颗粒的硅胶（料，如较粗颗粒的硅胶（1010

20、1515m m）。保护柱为保护柱为消耗品，通常分析消耗品，通常分析5050100100次样品，柱压力呈增大趋向次样品，柱压力呈增大趋向时就时就需要更换。需要更换。目前市场上目前市场上供应可供应可更换芯式设计保更换芯式设计保护柱，是由保护套和可更换式保护护柱，是由保护套和可更换式保护芯两芯两部分组成。部分组成。( (二二) ) 柱柱连接连接 柱出、入口的连接管的死体积柱出、入口的连接管的死体积越小越好越小越好一般一般常用窄孔常用窄孔( (内径内径0.13mm)0.13mm)的厚壁的厚壁(1.5(1.52.0mm)2.0mm)不锈钢管，以减少柱外死体积不锈钢管，以减少柱外死体积. . ( (三三)

21、 )柱温控制柱温控制在高效液相色谱分析中，柱温一般为室在高效液相色谱分析中，柱温一般为室温或接近室温温或接近室温。可以可以采用带有恒温加热系统的金属夹套采用带有恒温加热系统的金属夹套来保持色谱柱的温度。温度可以在室温到来保持色谱柱的温度。温度可以在室温到6060之间调节之间调节。对对凝胶渗透色谱仪，其柱温可从室温至凝胶渗透色谱仪，其柱温可从室温至150150实现精确控制。实现精确控制。四、四、检测检测系统系统 检测器实际上是一种换能装置，它检测器实际上是一种换能装置，它将流动相中组分含量的变化，转变成可测将流动相中组分含量的变化，转变成可测量的电信号量的电信号( (通常是电压通常是电压) )，

22、然后输入色谱，然后输入色谱工作站工作站。高效高效液相色谱的检测器很多，光学液相色谱的检测器很多，光学( (紫外紫外， 荧光，荧光， 折光检测器折光检测器) )；电化学；电化学( (极谱、极谱、电导、库仑、离子选择电极电导、库仑、离子选择电极) )等等。对于对于毛细管气相色谱和高效液相色谱，毛细管气相色谱和高效液相色谱，检测器的色谱峰展宽是柱外效应的一个主检测器的色谱峰展宽是柱外效应的一个主要来源要来源。HPLCHPLC用得最多的是用得最多的是UV UV 检测器。检测器。甲醇甲醇，水可，水可用作用作UV UV 检测器检测器的的流动相。流动相。( (一一) ) 检测器分类检测器分类1 1按性质或应

23、用范围分类按性质或应用范围分类有总体性能检测器和溶质性能检测器。有总体性能检测器和溶质性能检测器。总体性能总体性能检测器检测器：示示差折光、电导等检差折光、电导等检测器，测器，GCGC中的热导检测器也属于这类检测中的热导检测器也属于这类检测器。器。溶质性能溶质性能检测器检测器：紫紫外检测器、荧光检外检测器、荧光检测器、化学发光检测器、安培检测器、手测器、化学发光检测器、安培检测器、手性检测器等性检测器等。2 2按测量信号性质分类按测量信号性质分类有浓度型检测器和质量型检测器。有浓度型检测器和质量型检测器。浓度型浓度型检测器检测器：大部分大部分液相色谱检测器液相色谱检测器属这一类检测器属这一类检

24、测器。质量型检测器质量型检测器：库仑检测器。库仑检测器。（二）、常用检测器（二）、常用检测器1 1、紫紫外可见光检测器（外可见光检测器（UV/VIS UV/VIS detectordetector）：（）：（UVDUVD）又称紫外检测器）又称紫外检测器。约约有有8080的样品可以使用这种检测器，的样品可以使用这种检测器，是是HPLCHPLC中应用最广泛的检测器。适于吸收中应用最广泛的检测器。适于吸收紫外紫外- -可见光的物质可见光的物质。（1 1）、）、工作工作原理与结构原理与结构紫外检测器由光源、流通池和记录紫外检测器由光源、流通池和记录器器组成组成。工作工作原理是进入检测器的组分对特原理是

25、进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。律。紫外检测器的光学系统紫外检测器的光学系统（2 2）、）、UVUV检测器检测器分类分类：1 1）固定固定波长紫外吸收检测器波长紫外吸收检测器：低压低压汞灯提供固定汞灯提供固定254nm254nm或或280nm280nm。2 2）可变可变波长检测器（波长检测器（VWDVWD）：氘灯氘灯/ /卤钨灯卤钨灯做做光源，光栅分光源，光栅分光光3 3）光光二极管阵列二极管阵列检测器（检测器（PDADPDAD，PDAPDA， DAD DAD）：198219

26、82年惠普公司推出世界上首台年惠普公司推出世界上首台光光电二极管阵列检测器电二极管阵列检测器PDADPDAD有有10241024个二极管阵列个二极管阵列，可以，可以得到吸光得到吸光度、波长、时间度、波长、时间这样这样的的三维光谱三维光谱（3 3）、）、常用常用溶剂的紫外截止波长溶剂的紫外截止波长溶剂溶剂正已正已烷烷二硫二硫化碳化碳四氯四氯化碳化碳苯苯氯仿氯仿二氯二氯甲烷甲烷四氢四氢呋喃呋喃丙酮丙酮乙腈乙腈甲醇甲醇水水截止截止波长波长/nm/nm190190380380265265210210245245233233212212330330190190205205187187（4 4）、）、UV

27、DUVD的特点的特点: :1 1）灵敏度高灵敏度高1 11010-8-8g/mLg/mL（萘的甲醇溶液萘的甲醇溶液）。2 2）噪声低噪声低1.01.01010-4-4AUAU3 3）线性范围宽线性范围宽10 10 6 6（1 1 uvuv为最小单位为最小单位）4 4）应用广泛应用广泛5 5）属属溶质性能溶质性能检测器，检测器，适用于梯度洗脱适用于梯度洗脱。6 6）属浓度敏感型检测器属浓度敏感型检测器7 7）属属非破坏性检测器，可要用于制备色非破坏性检测器，可要用于制备色谱，也能与其它检测器串联使用。谱，也能与其它检测器串联使用。8 8）结构结构简单，维修方便。简单，维修方便。2 2、示差折光检

28、测器示差折光检测器：也也称为折光指数检测器（称为折光指数检测器（refractive refractive index detector RIDindex detector RID）：示示差折光检测器是除紫外检测器之外应差折光检测器是除紫外检测器之外应用最多的检测器。用最多的检测器。（1 1）工作工作原理与结构原理与结构RIDRID是是通过连续测定色谱柱流出液折光率通过连续测定色谱柱流出液折光率的变化来检测样品浓度的的变化来检测样品浓度的。就是就是检测参比池（流动相本身）和样品检测参比池（流动相本身）和样品池中流动相之间的折光率池中流动相之间的折光率差值差值，差值差值与浓与浓度呈正比。度呈正比

29、。（2 2）特点特点1 1）属总体属总体性能检测器，性能检测器，是通用型是通用型检检测器测器。它它对没有紫外吸收的物质，如高分对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等都能子化合物、糖类、脂肪烷烃等都能检测检测；示示差折光检测器不能用于差折光检测器不能用于梯度洗脱梯度洗脱2 2）适用于流动相紫外吸收本底大，不适用于流动相紫外吸收本底大，不适合用紫外检测器的体系适合用紫外检测器的体系；在在凝胶色谱中示差折光检测器是必不可凝胶色谱中示差折光检测器是必不可少的，尤其是对聚合物，如聚乙烯、少的，尤其是对聚合物，如聚乙烯、聚乙二醇、丁苯橡胶等的分子量分布聚乙二醇、丁苯橡胶等的分子量分布的的测

30、定测定；3 3）属浓度敏感型检测器属浓度敏感型检测器；4 4）缺点缺点是灵敏度是灵敏度低低：最小最小检测浓度达检测浓度达1010-6-6 1010-7-7g/mLg/mL；5 5）线性范围小于线性范围小于10105 5；6 6）对对压力和温度变化敏感压力和温度变化敏感。7 7）最最常用的溶剂是常用的溶剂是水水常常采用空气饱和溶剂作采用空气饱和溶剂作流动相流动相另外要另外要将检测器的流动相出口位置将检测器的流动相出口位置提高提高。五、五、色色谱谱数据处理系统数据处理系统- -色谱工作站色谱工作站工作站工作站自动自动定性和定性和定量分析定量分析1. 1. 定性分析定性分析微处理机微处理机在定量计算

31、时，一般通过在定量计算时，一般通过保留值来识别峰保留值来识别峰。具体具体采用采用下述两种下述两种方法方法定性定性：“时间窗时间窗”法法、“时间带时间带”法法（1 1）“时间窗时间窗”法法：t tR Rt t这是一种这是一种绝对保留时间绝对保留时间法，法，鉴别鉴别位位于预定于预定保留时间保留时间绝对绝对容容限内的限内的峰峰。每每个个峰的保留峰的保留值相同值相同，设置设置简单，简单，但用于识别保留时间相差很近的相但用于识别保留时间相差很近的相邻峰不大方便。邻峰不大方便。（2 2）“时间带时间带”法法：t tR R(1(1a a%)%)这是一这是一种相对种相对保留时间保留时间法法，鉴别鉴别位位于预定

32、于预定保留时间保留时间相对相对容容限内的峰限内的峰。对每个峰单独对每个峰单独设置，设置，设置较麻烦，设置较麻烦，但对但对识别相邻峰的分辨率较好识别相邻峰的分辨率较好2 2、定量分析定量分析（1)1)定量分析方法定量分析方法所有所有色谱数据处理机均支持面积归色谱数据处理机均支持面积归一、校正一、校正面积归一面积归一（这个通常就是（这个通常就是理论上的归一化法，理论上的归一化法，校正校正系数是相系数是相对校正因子或对校正因子或相对校正因子相对校正因子倒数倒数 ）、带、带范围范围因子因子的校正面的校正面积归积归一、一、外标法、内标法等定量计外标法、内标法等定量计算方法算方法。（2 2）IDID表表建

33、立建立合适的合适的IDID表（选择合适的表（选择合适的MODEMODE）对准确定量很重要。选择内容是）对准确定量很重要。选择内容是：用峰面积还是用峰高定量方法；：用峰面积还是用峰高定量方法；峰的识别用峰的识别用“时间窗时间窗”法还是法还是“时时间带间带”法；校正方法用法；校正方法用“单点单点”法法还是还是“双点双点”法。法。IDID表内容还包括表内容还包括：峰的保留时间；组分名等。：峰的保留时间；组分名等。第三节第三节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法HPLCHPLC主要有主要有液液固色谱法（吸附色谱法）固色谱法（吸附色谱法）；液液液分配色谱法液分配色谱法；化学键合相化学键合相色谱法色谱法

34、；离子色谱法；离子色谱法；凝胶色谱法凝胶色谱法（体积排阻色谱法）五（体积排阻色谱法）五大类。大类。一、一、液液- -固色谱法（固色谱法（LSCLSC）通常通常称吸附色谱法称吸附色谱法1 1分离机制分离机制：是根据填充剂吸附活性点对样品的是根据填充剂吸附活性点对样品的吸收系数不同而分离。吸收系数不同而分离。 2 2固定相：固定相：液固色谱固定相可分为极性和非极液固色谱固定相可分为极性和非极性两大类型。性两大类型。最最常见的极性吸附剂硅胶，其次是常见的极性吸附剂硅胶，其次是氧化铝、非极性吸附剂是活性炭。氧化铝、非极性吸附剂是活性炭。常使用的是常使用的是5 51010m m的特制全多孔的特制全多孔硅

35、胶。硅胶。3 3流动相：流动相：若使用极性固定相，应以弱极性的若使用极性固定相，应以弱极性的戊烷、己烷、庚烷作流动相的主体戊烷、己烷、庚烷作流动相的主体，再适当加入二氯甲烷、，再适当加入二氯甲烷、氯仿氯仿、甲甲醇醇、水等极性溶剂作为改性剂，以、水等极性溶剂作为改性剂，以调节流动相的洗脱强度；调节流动相的洗脱强度；若使用非极性固定相，应以水、甲若使用非极性固定相，应以水、甲醇、乙醇作为流动相的主体，可加醇、乙醇作为流动相的主体，可加入乙腈、四氢呋喃等改性剂入乙腈、四氢呋喃等改性剂。4 4应用应用液液固色谱法的特点是适于分离那固色谱法的特点是适于分离那些能溶于有机溶剂、具有中等分子些能溶于有机溶剂

36、、具有中等分子量的量的组分。组分。液液固色谱法的主要优点固色谱法的主要优点是是柱柱填料价格填料价格便宜便宜、对对样品的负载量样品的负载量大大、在在pH=3-8pH=3-8范围内固定相的稳定性较范围内固定相的稳定性较好好。是是大多数制备色谱分离中优先选用大多数制备色谱分离中优先选用的方法。的方法。二、二、液液- -液色谱法（液色谱法（LLCLLC）液液色谱法也称液液分配色谱法液液色谱法也称液液分配色谱法1.1.分离机制分离机制：依据它们在固定液与流动相中的溶依据它们在固定液与流动相中的溶解度，即溶质分子在固定相和流动解度，即溶质分子在固定相和流动相间的分配系数大小来进行分离的相间的分配系数大小来

37、进行分离的色谱方法色谱方法。2.2.固定相：固定相：由由载体和固定液载体和固定液组成。组成。常用的载体有下列几类：常用的载体有下列几类：表面表面多孔型多孔型载体载体全全多孔型多孔型载体全载体全多孔型微粒载体，多孔型微粒载体，又称堆积硅珠又称堆积硅珠常用的固定液有下列常用的固定液有下列几种几种： ， 氧二丙腈（氧二丙腈（ODPNODPN）聚聚乙二醇（乙二醇（PEGPEG）十八十八烷（烷（ODSODS）角鲨烷角鲨烷固定液等。固定液等。现在化学键现在化学键合固定相已渐渐取代了合固定相已渐渐取代了液液色谱中固定相。液液色谱中固定相。3. 3. 流动相：流动相：（1 1）正相液液分配色谱）正相液液分配色

38、谱：正相色正相色谱谱：固定液固定液极性极性 流动相极流动相极性（性（NLLCNLLC）流动相流动相主体为已烷、庚烷，可加入主体为已烷、庚烷，可加入20%20%的极性改性剂，的极性改性剂，如氯仿如氯仿、二氯甲、二氯甲烷烷、甲醇、甲醇、乙腈等。、乙腈等。（2 2）反相液液分配色谱）反相液液分配色谱：反相色反相色谱谱：固定液固定液极性极性 流动相极流动相极性（性（RLLCRLLC）流动相流动相主体为水，可加入主体为水，可加入20%20%的极的极性改性剂，性改性剂，如甲醇、四氢呋喃如甲醇、四氢呋喃、异、异丙醇等。丙醇等。三、三、化学键合相化学键合相色谱法（色谱法（bonded bonded phase

39、 chromatography BPCphase chromatography BPC）1 1、化学键合相化学键合相介绍介绍利用利用化学反应将固定液的官能团键化学反应将固定液的官能团键合在载体表面合在载体表面。化学键化学键合固定相一般都采用硅胶（合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。薄壳型或全多孔微粒型）为基体。2 2、化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1 1）使用过程中不流失）使用过程中不流失，使用寿使用寿命命长长。（2 2）有很好的化学稳定性和热稳）有很好的化学稳定性和热稳定性。定性。（3 3）适于梯度洗脱。）适于梯度洗脱。（4 4）适用于分离几乎所有类型的）适用于

40、分离几乎所有类型的化合物。化合物。（5 5）柱效高）柱效高。（6 6）载样量大。）载样量大。3 3、键键合相色谱法分类合相色谱法分类分为分为正相键合相色谱法和反相键合正相键合相色谱法和反相键合相相色谱法色谱法（1 1）正相键合相正相键合相色谱法色谱法极性极性小的组分先出柱，极性大的组小的组分先出柱，极性大的组分后出柱分后出柱。适用：分离油溶性或水溶性的极性适用：分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。和强极性化合物。固定相固定相：共共价结合到载体上的基团都是极性价结合到载体上的基团都是极性基团，如胺基、氰基、二醇基等。基团，如胺基、氰基、二醇基等。流动相流动相：非极性溶剂非极性溶剂，如庚烷、已

41、烷及异辛，如庚烷、已烷及异辛烷等。由于固定相是极性，因此流烷等。由于固定相是极性，因此流动溶剂的极性越强，洗脱能力也越动溶剂的极性越强，洗脱能力也越强，即极性大的溶剂是强溶剂。强，即极性大的溶剂是强溶剂。2 2反相键合相色谱反相键合相色谱反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性 20002000化合物化合物1.1.分离原理分离原理溶质在两相之间按分子大小进行分溶质在两相之间按分子大小进行分离离。大分子大分子不能不能进入胶进入胶孔而受到排阻孔而受到排阻，先出先出柱柱；小小的分子可以的分子可以进入胶进入胶孔并渗透到颗孔并渗透到颗粒中粒中，后后出柱出柱。2.2.固定相固定相凝胶凝胶：化学惰性多孔性的聚合

42、化学惰性多孔性的聚合材料材料（ 1 1 ）软质）软质凝胶凝胶如如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等等适用于适用于水为流动相。水为流动相。 （ 2 2 ）半硬质）半硬质凝胶凝胶如如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶（苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联聚苯乙烯凝胶交联聚苯乙烯凝胶）适用于适用于非极性有机溶剂。非极性有机溶剂。 （ 3 3 ）硬质）硬质凝胶凝胶如如多孔硅胶、多孔玻珠多孔硅胶、多孔玻珠等等 3. 3.流动相流动相根据所用的流动相不同，凝胶色谱分为根据所用的流动相不同，凝胶色谱分为两类：两类：用水溶剂作流动相称为凝胶过滤色谱；用水溶剂作流动相称为凝胶过滤色谱；用有机溶剂作流动相的称为凝胶渗透色用有机溶剂作流动相的称为凝胶渗透色谱谱。