DNA提取方法进展.doc

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1、40 DNA 中国海洋药物 杂志 2004 年第 2 期 ( 总第 98 期 ) 提取方法进展 张 宁 , 王凤山 ( 山东大学 药学院 生化与生物技术药物研究所 , 山东 济南 250012) 摘 要 : DN A 的提取是分子生物学研究的 基础技术 , 提取的 DN A 的纯度及结构完 整性是进行基因工程各项 研究所必需的条件 。 近年来一些新的或改进的 DNA 提取纯化方 法不断出现 , 本文 对从陆生 动物 、 植物 、 微生 物以及海洋生物提取 DNA 的方法进行综述 。 关键词 : DN A; 提取 ; 动物 ; 植 物 ; 微生物 ; 海洋生物 中图分类号 : R916; T Q

2、 464. 6 文献标识码 : A 文章编号 : 1002 3461( 2004) 02 0040 07 Advances of DNA extraction methods ZHA N G N ing , WA N G F eng shan ( Inst itute of Biochemic and Biot echnological D r ugs , School of Phar macy , Shandong U ni versi ty , Jinan 250012, Chi na) Abstract: DNA ext ract ion is a basic technolog y o

3、f molecular biology. T he purit y and t he integrali t y of DN A structure are necessary for different ex periments of gene engineering. In recent years there have been some new or improved DN A ext raction methods appeared. T he methods of D NA ext raction f rom animals, plants, m icroorganisms and

4、 m arine organisms w ere summarized in t his art icle. Keywords: DN A; ext raction; animals; plant s; microorganisms; marine organisms 自 20 世纪 50 年代 Watson 和 Crick 提 出 DNA 双螺旋模型以来 , 分子 生物学在广 度和深度上都获得空前的发展。 DNA 作为 分子生物学研究的基础 , 在生物领域尤其是 遗传学方面的研究日渐深入 , 在此基础上产 生的基因工程技术已在医药、农业、畜牧业等 领域获得广泛应用。研究和应用 DN A 的基

5、 础是提取纯化结构完整的 DNA , 为此针对不 同来源的 D NA 建立 了不 同的 提 取纯 化方 法。本文对从陆生动物、植物、微生物以及海 洋生物来源的 DN A 的传统提取方法及近年 来诸多的改良方法进行综述。 1 动物来源的 DN A 的提取 1. 1 经典提取方法 酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂 解法是提取 DN A 最为经典的方法 , 目前很 多方法的改进都是在这些方法的基础上进行 的 , 这三种方法均利用蛋白酶 K 和十二烷基 硫酸钠 ( SDS) 消化破碎细胞。在前两种方法 中裂解液先用酚 / 氯仿去除蛋白质 , 再分别用 乙醇或异丙醇沉淀 DNA 。甲酰胺法是利用 高浓

6、度的 甲酰 胺解 聚蛋 白 质与 D NA 的结 合 , 然后利用透 析来处理 D NA 样 品。这些 经典方法获得的 DN A 纯度很 高 , 能够满足 各种试验的要求 , 但操作繁琐 , 用时长 , 且所 用试剂具有一定的毒性。 1. 2 玻璃棒缠绕法 该法用盐酸胍裂解细胞 , 然后将细胞裂 解物小心铺在离心管中的乙醇上 , 用一个带 钩的或前端为 U 形的玻璃棒在这两层液体 的交界面慢慢搅 动 , 沉淀出的胶 状 D NA 缠 绕在玻璃棒上。玻璃棒上的 DN A 经多次乙 醇浸泡并于室温下蒸干乙醇 , 由胶状逐渐回 中国 海洋药物 杂志 2004 年第 2 期 ( 总第 98 期 ) 缩

7、 , 然后浸入 T E 中过夜 , 使其重新吸水膨胀 进而和玻璃棒分离。这种方法对操作技术要 求较高 , 但简单快速。 1. 3 血细胞 DNA 的快速提取法 采用非离子变性剂 N P 40( 乙基苯基聚 乙二醇 ) 代替 SDS 裂解细胞 , 提取细胞核 , 然 后用酚 / 氯仿抽提 DNA 。这样从血液中分离 获得的 DN A 纯度高 , 能够满足 各种临床检 验和实验的需要。也可采用 N P40 和 T ween - 20 同时作用破碎细胞膜 , 以避免 SD S 对以 后步骤的负面作用。 Basuni 等 采用了 4 种常用的从血液中 提取 DN A 的 方法 : High P ure

8、 V iral N ucleic 试剂盒法、 Q IAamp 试剂盒法、 T riPureT M 试 剂分离提取法以及经典酚抽提法 , 对通常作 抛弃处理的血凝块进行人 DN A 及病毒 DN A 的抽提 , 发现前两种方法可以迅速高效获得 目的 DNA , 从 而 建 立 了 由 血 凝 块 中 提 取 D NA 的方法 , 扩大了临床检验样本的来源。 1. 4 玻璃颗粒吸附法 在该法中首先利用含异硫氰酸胍的细胞 裂解液裂解细胞 , 然后加入含有能够与 DN A 结合的玻璃颗粒的缓冲液 , 经沉淀收集结合 染色体 DN A 的玻璃颗粒 , 利用 洗脱液进行 洗脱获得 DNA 。不仅玻璃颗粒可

9、以与 DN A 进行结 合 , 一定 大小的 硅胶 颗粒 也可 以与 D NA 进行结合 , 据此 , 不少实验工作者实践 了很 多 利 用 颗 粒结 合 DN A 的 提 取 方 法。 Pichler 等 在 从 抹 香 鲸 ( Phy seter macro cep hal us ) 牙齿及骨骼中 抽提 DNA 时采用了 一种以二氧化硅为吸附介质的方法 , 从抹香 鲸标本骨骼组织中钻取的少量粉末中获得了 足够用于分析的 DN A 产物 , 此 方法扩大了 对稀 有 哺 乳 动 物 D NA 研 究 的 取 材 范 围。 Caldarelli stefano 等 在从福尔马林固定、石 蜡包埋

10、的人体组织标本中提取 DN A 时利用 小磁珠 作为 结合核 , 也 获得 了理 想的 纯化 D NA 。很多试剂公司也 依此设计生 产了许 多颗粒提取试剂盒 , Pinto 等 就探讨了采用 41 Gibco 公司的 GlassMA X 系统 , 对福尔马林固 定的组织 进行 DNA 提取 的具体操 作方法 , 目前这些试剂盒在临床上广为应用 , 省时省 力。 1. 5 三乙醇胺月桂基硫酸盐 ( T L S) 法 由于常规方法中使用 的蛋白酶 K 的水 解条件不好掌握 , 采用 T L S 来提取组织、细 胞以及 外 周 血 DNA 可以 克 服 这 一 弊 端。 T LS 是一种较强的表面

11、活性剂 , 将其直接作 用于细胞或组织匀浆 , 可迅速溶解细胞膜、核 膜 , 而且蛋 白质与其 结合后即 失去对 D NA 的结合 , 进一步的纯化可采用常规方法。 1. 6 临床病理标本的 DNA 提取方法 由于 PCR 技术不仅可用于基因分离、核 酸序列分析 , 还可用于突变体和重组体的构 建、基因表达调控研究、基因病的诊断及肿瘤 发生机理的探讨等。近年来 , PCR 技术已广 泛应用于病理学研究 , 尤其对福尔马林固定 石蜡包埋病理标本进行相关的研究更成为关 注的 焦 点。对 于 从 这 些 病 理 标 本 中 提 取 DNA 的方法研究也很多。一般采用酚 / 氯仿 抽提法 , 该法虽

12、然效率较高 , 但费时费力 , 而 且其操作中要求多次离心 , 增加了样品污染 的可能性。近年来很多高效灵敏的方法在实 践中得以采用 , 这些方法通常采用加热或微 波法 去除包埋的石蜡 , 使用 Sephadex G 50 柱色 谱 或 盐 析 法 等 去 除 蛋 白 质。高 文 涛 等在研 究福尔马林 固定石蜡 包埋组织 DNA 提取方法对 P CR 的影响时 , 发现在组 织切片中加入螯合树脂 ( Chelating Resin, 亚 氨基二乙酸 ) 提 取获得的 DN A 可取得较好 的 PCR 扩增结果。 Coombs 等 则采用热循 环方法 , 将标本上的蜡融入样品溶液 , 在酶的

13、作用下进行裂解 , 然后用 Chelex 100 进行吸 附 , 离心去蜡 , 这种方法安全、简便、有效、经 济。 1. 7 盐析法 该法用饱和氯化钠代替有机溶剂去除蛋 白质 , 所获得的 DN A 质量可以满足 PCR 模 1 2 3 4 42 板的要求 , 但产率相对较 低 , 纯度较差。谭建 明等 对上述盐析法进行了改进 , 即将处理 过的样本加入 SDS 和蛋白酶 K 后 , 在 56 ! 消化 1h, 然后用饱和氯化 钠沉淀蛋白质 , 并 经离心除去 , 上清直接用乙醇沉淀 DN A 。该 法简化了 DN A 的抽提步骤 , 可 用于人体各 种样本 DNA 的提取 , 所获 DN A

14、 的纯度可以 满足各种检测的需要。 2 植物来源的 DN A 提取 利用 基因工程 手段对植 物进行 定向改 造 , 已成为当今植物育种学发展的一个新领 域 , 植物基因工程操作离不开植物基因组总 D NA 的制备 , 不同植物的核酸结合蛋白的情 况各 不 相 同 , 因 而 要 采 取 不 同 的 提 取 方 法 。由于植 物中次生代谢产 物 多酚 类化合物可介导 DN A 降解 , 而 多糖的污染 也是影响植物 DN A 纯度最常见的问 题 , 这 些多糖能抑制限制 酶、连接酶及 DN A 聚合 酶等酶类的生物活性。因此要从富含多酚和 多糖的植物组织中分离获得高质量的基因组 D NA 也并

15、非易事 。目前采用的方法有以 下几种。 2. 1 十六烷基三乙基溴化铵 ( CT A B) 法 CTAB 是一种阳离子去污剂 , 它能与核酸 形成复合物 , 这些复合物在低盐溶液中会因溶 解度的降低而沉淀 , 而在高盐溶液中可解离 , 从而使 DNA 和多糖分开 , 再用乙醇沉淀 DN A 而除去 CTAB 。在该法中使用的聚维酮 ( PV P) 与多酚结合形成复合物 , 从而可有效避免多酚 类化合物介导的 DNA 降解 。王卓伟等 在对桑 叶 DNA 提 取方 法 研究 过 程中 发 现 PV P 还能有效地去除多糖。罗志勇等 在研 究中对 这种 方法 进行 了 几点 改 进 : # 提 高

16、 CTAB 的浓度 ; 对于含多酚类较多的植物 , 增加 CTAB 提取缓冲液中巯基乙醇的含量 , 同 时加入 PVP 使其与多酚类物质结合形成复合 物 ; % 增加低盐沉淀缓冲液的量 ; &增加高盐 溶液中盐的浓度。用改进的方法从人参、西洋 9 10 11 12 13 14 中国海洋药物 杂志 2004 年第 2 期 ( 总第 98 期 ) 参、三七等药用植物中分离获得了高纯度的 DNA。 Porebski 等 在沉淀 粗提 DNA 时 , 将 提取缓冲液中氯化钠的浓度提高至 2. 5mol L 以使 DNA 在高盐缓冲条件下优先沉淀 , 可更有效地除去多 糖。 Stein 等 对传 统的

17、CTAB 法进行了优化 , 创建了一种从新鲜草本 植物样本中提取 DNA 的方法。首先在特制的 有 96 个孔的托盘上种植植物样本 , 并依照不 同样本在托盘中的位置进行编号 , 然后取适量 植物叶子分装在充满提取液的塑料袋中 , 除去 袋中的空气并封口 , 再用特制的手工匀化器将 各袋中的样本混匀 , 56 ! 孵育 1h 后将袋中的 液体 取 出 进行 离心 以及 DNA 的沉 淀。 Xin 等 则采用简易的 96 孔托盘作为提取时的 容器 , 将多种植物样本经研磨处理后分别放在 不同的孔中进行提取 , 在一天内由一人就可完 成上千个样本的 DNA 提取 , 为高通量植物基 因分析及筛选提

18、供了极大的便利。 2. 2 SD S 法 为了避免 CT AB 法试验步骤多、操作繁 琐的不足之 处 , 近 年来又 提出 了利 用 SD S T ris Cl EDTA 等直接裂解细胞使其释放出 DNA 的方法 。在该法后续的 DN A 纯化 过程中通常采 用酚 / 氯仿处理 , 但对 于植物 DNA 纯化不是一个很好的选择 , 因为酚的使 用可降低 DNA 的提取效率和纯度。王景雪 等 在用该法提取 DNA 的过程中采用较大 的离心力和较长的离心时间 , 然后用氯仿 - 异戊醇代替酚来去除变性蛋白质 , 从而克服 了由于酚的掺入及残留对以后酶切带来的困 难。杨婉身等 用巯基乙醇代替 SD

19、S, 对大 豆 DN A 分 离提 取能 够更 有 效地 去除 蛋白 质 , 而且可以有效防止褐变 , 获得天然双链高 分子 量的 DN A 产 物 , 并且 减 少 了 SDS 对 PCR 、随 机扩 增多 态性 DN A 技术 ( R andom amplified polymorphic DNA , RAP D) 等操作 的影响。王得元等 在对辣椒 DN A 进行提 取时为了提高 DN A 的产率将待提取的植物 材料首先在液氮中研磨成粉末 , 并且针对辣 15 - 1 16 17 - 18 19 20 21 中国海洋药物 杂志 2004 年第 2 期 ( 总第 98 期 ) 椒叶子中多酚

20、类物质极少的特点将其中的加 株的性质等。 K eunosky 等 2+ 24 43 发展了一种以 入 PV P 的步骤省去 , 消除了 P V P 对以后操 Zn 诱导 D NA 沉淀 的方法 , 在该法中利用 作的影响。 2. 3 氯化苄法 李思光等 在对猕猴桃的基因组 DN A 一定浓度的 Z nCl2 溶液使一定体积的细菌菌 液质粒 DNA 大量沉淀 , 无需多次离心 , 大大 简化了抽提的步骤。 提取过程中选用了氯化苄法 , 与其他方法相比 近 年 来 , 一 些 生 物 技 术 公 司 , 比 如 该法的得率较高 , 其原因可能是氯化苄不仅可 与植物细胞壁上的多糖羟基反应生成醚 ,

21、而且 与细胞液中多糖物质的羟基反应 , 起到破坏糖 链的作用 , 利于 DNA 的释放和提纯。 2. 4 高盐低 pH 法 该法中所用的提纯试剂仅为无 机盐和异 丙醇。通常采 用的无机 盐为醋酸 钾 , 低 pH 的醋酸钾是有效的蛋白质沉淀剂。与一般氯 仿 - 异丙醇反复抽提去除蛋白质的操作相比 该法操作更方便省时 , 所需样品量少 , 适用于 濒危植物 DN A 的提取。 2. 5 果胶酶法 St even 等 采用果胶酶对植物细胞破 碎后的抽提混合物进行消化处理使与 DN A 共沉淀的胶状物质分解成小的片段 , 从而无 法与 DN A 一起沉淀下来 , 降低了 DN A 的纯 化难度 ,

22、提高纯化效率。 3 微生物来源 DN A 的提取 常规的微生物 DNA 提取多是根据某种 微生物的具体特点选择合适的方法。在实际 的科学研究过程中 , 很多科学工作者通过实 践总结出许多快速实用的提取方法 , 现择其 中比较典型的加以总结。 3. 1 细菌质粒的提取方法 质粒是独立于细菌染色体 DN A 之外的 环状 DN A, 它能携带外源基因进入细菌进行 扩增 , 或表达外源基因 , 是基因工程中常用的 载体 , 在 DNA 重组技术、 DNA 测序、转基因 等方面具有广泛的应用。对于细菌质粒的提 取比 较经 典的 方 法有 : 碱裂 解 法、煮沸 法、 SDS 裂 解 法以 及 T ri

23、t on 溶菌 酶 裂 解法 等。 这些方法的选择取决于质粒的大小、细菌菌 Promega 公司及 Q iagen 公司 等纷纷 推出质 粒抽提试剂盒 , 这些试剂盒多运用树脂材料 或硅胶来特异性的吸附质粒 D NA , 提取过程 用时少 , 效率高。 3. 2 真菌 DN A 提取方法 对真菌 DN A 的提 取关键是破 碎细胞 , 通常采取酶解破壁法或以液氮冷冻处理增加 细胞壁脆性的物理破壁法。在这两种方法中 酶解破壁法较为简单 , 易于操作和控制 , 而物 理破壁法在处理过程中容易造成细胞核的大 量破损。在提取获 得核酸 - 蛋白 质复合物 后 , 对其中蛋白质的沉淀也多采用传统的氯 仿

24、 - 异戊醇沉 淀法或高 盐沉淀法。韩利刚 等 用 CT AB 法直接从丝状真菌的新鲜菌 丝中 提取 DN A, 并 将所 提 取 的 DN A 进行 RA PD, 得到 了较清晰的扩 增图谱。 L oeff ler 等 为满足快速灵敏准确的临床检验的需 要 , 利用 MagNA Pure L C 系统建立了一种实 用的快速提取方法 , 该法自动化程度高 , 避免 了可 能的交叉污染。 M anian 等 在对真菌 进行 D NA 抽提 时采 用几 个 循环 的快 速制 冷、煮沸 以破碎 真菌细胞 壁 , 并通 过 Q iagen 公司的 Q IA quick DN A 纯化柱 , 迅速从极微

25、 量的真菌中获得高纯度的 D NA 大分子。 3. 3 结核杆菌 DN A 的提取方法 利用 PCR 微孔板杂交技术检测临床标 本中结核杆菌 DN A 是诊断结核杆菌感染的 一种快速灵敏和特异的方法。从不同的临床 标本中获 得 DN A 是 检测 准 确和 成功 的关 键。而不同来源的 结核杆菌又分别受到不同 来源材料 的影响 , 所以提 取方法各 不相同。 同时由于 结核杆菌的细 胞壁比较 厚不易破 碎 , 一般的微波法、异硫氰酸胍法、冻融法等 22 23 44 难以破坏结核杆菌的细胞壁。通常采取的方 法有 : 经 典酶 - 酚 - 氯仿法 , 碱 - SDS 裂解 法 , 碱裂解煮沸法 ,

26、 超声裂解法 , Chelex - 100 法 , 玻璃粉 - 硅吸附法等。杨正林等 通过 对以上几种方法的 比较发现玻璃粉 - 硅吸附 法操作简单 , 假阳性低 , 适合临床检测使用。 3. 4 土壤微生物总 DN A 的提取方法 土壤中细菌的含量丰富 , 种类齐全 , 从中 提取细菌 DN A 可用于检测不可培养的细菌 , 跟踪某些目标菌或重组基因在自然环境中的 行为 , 也可用来解释土壤微生物生态系统中的 基因的多样性及其随环境的变化。从土壤中 提取 和 纯 化 DNA 是 最 关 键 的 技 术 之 一。 Courtois 等 对比了在土壤中直接裂解微生 物体、然后提取 DNA 和先将

27、微生物菌体通过 梯度离心与土壤 颗粒分开再进行提取的方法 , 利用 PCR 技术以及杂交技术检测不同方法获 得 DNA 的种类和纯度 , 发现前一种方法具有 更高的效率 , 能够提取获得较多微生物物种的 DNA。张瑞福等 采用 SDS 高盐提取法和透 析袋回收法对 9 种不同来源的土壤进行微生 物 DNA 的提取 , 与通常采用的对菌体细胞的 超声破碎法以及对粗提 DNA 的微型柱纯化法 相比 , 既保证了一定提取与回收效率 , 又兼顾 了 DNA 的质量 , 使 DNA 在提取和纯化过程中 不会受到损伤。 4 海洋生物 DNA 的提取方法 海洋 是地球上最大的生物资源库 , 同时 由于海水的

28、保护使海洋生物变化很少 , 物种 得到较好的保存 , 这样就为研究生命现象的 基本问题提供了丰富的资料。在利用这些资 源探讨诸如生命的起源、生物进化、生物与环 境的关系、改造海洋生物以为人类服务 ( 如生 产某种 药物 ) 时离不开对生 物核酸的 研究。 对于海洋来源的动物、植物、微生物由于其不 同于陆生生物的组织和细胞结构特点往往采 用不同的 DN A 提取方法。 31 中国海洋药物 杂志 2004 年第 2 期 ( 总第 98 期 ) 鱼 ( Pseudosciaena cr ocea ) 肌 肉 样品 基 因 组 DNA 进行提取时发现 , 经福尔马林、乙醇及 含有 EDT A 的 乙醇

29、保存的样 品可以同鲜活 样品和冷冻样品一样获得基因组 DNA , 但相 比之下采用乙醇作为固定剂更方便快速 , 所 提取的 DNA 用于 RA PD 分析 , 获得了满意 的效果。杨文新等 利用 75% 的乙醇固定 鲍鱼 ( H aliotis discus ) 样本并进行 DN A 的提 取 , 证明用乙醇固定海洋动 物组织是一种切 实可行的方法 , 材料处理后可同步提取 , 增加 了实验的同步性、可比性 , 适用于大量样本的 提取。由于组织中 含有许多 D NA 酶 , 绝大 多数 DN A 酶需要一个二价阳离子作为辅助 因子 , 因此采用含适量 EDT A 的乙醇固定剂 是野外标本采集和

30、运输的一种更简便有效的 方法。 韩兵社等 针对传统的有机溶剂提取 工艺进行改进 , 应用多种萃取液体系从废弃 物鱿鱼肝脏中提取核酸 , 与原工艺相比 , 核酸 提取产量提高 30% 60% , 整体工艺得到简 化 , 而且避免了有机物的残留。 赤潮是在特定的环境前提条件下 , 海水 中的某些浮游生物、原生动物或细菌爆发性 增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害 生态现象 , 对海洋渔业、水产资源以及人类的 健康造成很大的威胁。发生赤潮的生物类型 主要为藻类 , 铜绿微囊藻 ( Mi crocyti s aerugi nosa) 是造成赤潮的藻类之一。陆源等 用 乙醇乙醚混合液对纯化的铜绿微囊藻

31、作预处 理 , 破 坏 了其 胶 质鞘 , 从 而使 蛋 白 酶 K 和 SDS 能更好地直接作用于其细胞壁 , 细胞内 的 D NA 释放完全 , 提高了总 DN A 的得率。 通过提取获得的 DN A 有助于开展对有害藻 类的研究 , 为防范赤潮提供依据。 在对紫菜 ( Porp hyr a sp . ) 进 行 DN A 提 取时 , 郭宝太等 先用海螺酶处理样品制备 紫菜体细胞 , 然后用 SDS 和蛋白酶 K 裂解细 胞提 取总 DN A , 再用 Wizard D NA clean up 张海琪等 在对不同方法保存的大黄 树脂进行纯化。经海螺酶处理的紫菜细胞解 28 29 30 中

32、国海洋药物 杂志 2004 年第 2 期 ( 总第 98 期 ) 决了通常 采用的液氮破 碎细胞后裂 解物黏 extraction from paraffin w ax 45 embedded tissues J . J Clin 稠、 DNA 得率低且 有严重的 多糖污 染等难 Pathol: Mol Pathol, 1999, 51( 1) : 48. 题。但这种方法对植物组织需求量较多 , 不 5 Chan PKS, Chan PPC, T o KF, et al. Evaluation of ex 适于个体体积小的紫菜。刘 必谦等 采用 traction methods from pa

33、raffin wax embedded tissues for PCR amplification of human and viral DNA J . J Clin Pathol, 美国 Roche 公司的 DN A Isolat ion K it for Cell and T issue 和 上海生工 公司的 U N IQ 10 小 量柱式基因组 DN A 提取试剂盒对个体体积 较小的圆 紫菜 ( Porp hy ra subor biculata ) 、铁 钉菜 ( I shige okamurae) 等进行 DN A 的提取 , 获得高纯度的基因组 DN A , 完全能满足酶切 片段长

34、度多态性 ( Am plif ied F ragment L ength Polymorphism, A FL P) 技术的需要。 陈子桂 等 以 海洋 尾丝 虫 ( Uronem a mar inum ) 为材料 , 针对纤毛虫难以建立培养 以及个体 丰度不高等特点 , 就微量条件下提 取 DNA 的方法进行了探讨 , 成 功地获得了 活体直接提取、活体酚 / 氯仿抽提、固定标本 直接提取以及固定标本酚 / 氯仿抽提等四种 简便有效的微量 DN A 提取方法 , 解决了纤 毛虫微量 DN A 提取的困难。 综合 DN A 的提取方法 , 虽然不 同生物 D NA 的提取方法不尽相同 , 但各

35、种提取方法 也有很多相通之处 , 可以相互借鉴。随着生 物技术的飞速发展 , 对这一技术的经验总结 将会越来越多 , 一些生物领域新 的 D NA 提 取方法也将逐渐固定下来 , 更为简捷 、高效的 方法也必将出现 , 为基因工程提供更高纯度 的 DNA 。 参考文献 : 1 Basuni AA, Butterw orth LA, Cooksley G, et al . An effi cient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA J . J Viral H ep a

36、t, 2000, 7( 3) : 241. 2 Pichler FB, Dalebout ML, Baker CS. Nondestructive DNA extraction from sperm w hale teeth and scrimshaw J . Mol ecol notes , 2001, 1( 3) : 106. 3 Caldarelli- Stefano R, Vago L, Bon etto S , e t al. Use of magn etic beads for tissue DNA extraction and IS 6110 My cobacterium tub

37、erculosis PCR J . J Clin Pathol Mol Pathol . 1999, 52( 3) : 158. 4 Pinto AP, Villa LL. A spin cartridge system for DNA 2001, 54( 5) : 401. 6 How e JR, Klinstra DS, Cordon Cardo C. DNA extrac tion from paraffin embedded tissues using a salting out proce dure: a reliable method for PCR amplification o

38、f archival ma terial J . H istol H istop athol, 1997, 12( 3) : 595. 7 高文涛 , 张泽兵 , 孙 宏晨 , 等 . 福 尔马林固 定石蜡包 埋 组织 DNA 提取方法对 PCR 的影响 J . 白求恩医科大 学学 报 , 1999, 25( 1) : 103. 8 Coombs NJ, Gough AC, Prim rose JN. Optimisation of DNA and RNA extraction from archival formalin fixed tissue J . Nucleic A cid s Re

39、s, 1999, 27( 16) : 1537. 9 谭建明 , 谢桐 , 徐琴君 , 等 . 快 速盐 析法 提取 DNA 在 HLA 基因分型中 的应用 J . 中华 器官移 植杂 志 , 1996, 17 ( 1) : 9. 10 刘萍 , 代红军 , 张立杰 , 等 . DNA 提 取方法 与植物 种 类的效应比较 J . 宁夏农林科技 , 1998, 1: 15. 11 Fu RZ, W ang J, Sun YR, et al. Extraction of genom ic DNA suitable for PCR analysis from dried plant rhizome

40、s/ roots J . Biotechnique , 1998, 25( 5) : 796. 12 Kim CS, Lee CH , S hin JS , et al . Simple and rapid m ethod for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP J . N ucleic Acid s Res, 1997, 25 ( 5) : 1085. 13 王卓 伟 , 余茂 德 , 鲁成 . PVP 在 桑叶总 DNA 提取 中 的应用 J . 西南农业大学学报 ,

41、 2001, 23( 1) : 61. 14 罗志勇 , 周 钢 , 陈湘晖 , 等 . 高 质量植 物基因 组 DNA 的分离 J . 湖南医科大学学报 , 2001, 20( 2) : 178. 15 Porebski S , Bailey LG, Bernand R. Modification of a CT AB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components J (. P lant Mol Biol Rep , 1997, 15( 1) : 8. 1

42、6 Stein N, H erren G, Keller B. A new DNA extraction m ethod for high - throughput marker analysis in a large - genome species such as T riticum aestivu J . Plant Breed , 2001, 120( 6) : 354. 17 Xin Z, Velten JP, Oliver MJ, et al. High throughput DNA extaction method suitable for PCR J . Biotechique

43、s , 2003, 34( 4) : 820. 18 邱国华 , 徐增学 , 曹吉祥 , 等 . 一种简便实用的提取植 物 DNA 的方法 J . 植物生理学通讯 , 1997, 33( 5) : 368. 19 王景雪 , 孙毅 , 高武军 . 一种简便实用 的植物总 DNA 36 37 46 提取方法 J . 山 西大学 学报 ( 自 然科 学版 ) , 2000, 23 ( 3 ) : 271. 20 杨婉身 , 王西瑶 , 荀林 , 等 . 大豆等 植物材料 DNA 提 取方法的改进 及其干 扰机 制的 探讨 J . 西北 农业 大学 学 报 , 1996, 14( 2) : 153.

44、 21 王得元 , 彭世清 , 刘志 昕 , 等 . 辣椒 基因组 DNA 提 取 与 RAPD 分析 J . 江西农业大学学报 , 1998, 20( 2) : 180. 22 李思光 , 罗玉萍 , 陈万 秋 , 等 . 猕猴 桃基因组 DNA 的 提取及其 RAPD 扩增 研 究 J . 南 昌 大学 学 报 ( 理 科版 ) , 2001, 25( 3) : 264. 23 Steven H, Rogstad, Brian Keane, et al. DNA extraction from plants: the use of pectinase J . Plan t Mol Biol

45、 Rep , 2001, 19( 2) : 353. 24 Kejnovsky E, Kypr J. DNA extraction by zinc J . N u cleic Acids Res, 1997, 25( 9) : 1870. 25 韩利刚 , 袁毅 , 王罡 . 丝状真菌组织 DNA 的提取 J . 生物技术 , 1996, 9( 6) : 38. 26 Loeffler J, Schm idt K, Hebart H, et al. Automated ex traction of genomic DNA from medically im portant yeast species and filamentous fungi by using the M agNA Pure LC system J . J Clin Microbiol , 2002, 40( 6) : 2240.