PCR引物设计方法综述.doc
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1、农业 基础 科学 现代 农业 科技 2011 年 第 17 期 摘要 PCR 引物设计方法综述 尤 超 赵 大球 梁 乘榜 周 春华 ( 扬州大学园艺与植物保护学院 , 江苏扬州 225009) 为 了获 得 PCR 引 物设 计 的理 想方 法 , 笔 者 运用 NCBI 等 数据 库 与引 物 设 计软 件 Primer Premier 5.0 等 工具 , 结 合 引 物设 计 的原 则 , 完成 目的 基因 的引 物设 计 , 并 对设 计后 的引 物进 行 BLAST 比对 、 综合 评价 和基 因的 重新 检测 等分 析 , 据 此对 PCR 反应 条件 进 行优 化研 究 。 结
2、果 表明 , 通过 这些 数据 库和 软件 所设 计的 引物 能基 本满 足后 续的 RT-PCR 反 应 , 可 以进 行进 一步 的分 子生 物学 研究 。 关键 词 PCR; 引 物设 计 ; 软 件 ; 分 子生 物学 中图 分类 号 S188 文 献 标识码 A 文 章编 号 1007-5739( 2011) 17-0048-04 Review of the PCR Primer Design Method YOU Chao ZHAO Da-qiu LIANG Cheng-bang ZHOU Chun-hua * ( College of Horticulture and Plant
3、 Protection, Yangzhou University, Yangzhou Jiangsu 225009) Abstract In order to obtain an ideal method of PCR primer design, the author completed primer design of target gene, using some databases and software tools for primer design, such as NCBI, Primer Premier 5.0 and so on, combined with the pri
4、nciple of primer design.Then made a research on optimization of conditions for PCR reaction after the designed primer was analyzed through BLAST comparison, comprehensive evaluation and gene re- test analysis. The results indicated that primers designed through these databases and softwares could ba
5、sically meet the requirements of following RT- PCR reaction and could make an in-depth study of molecular biology., Key words PCR; primer design; software; molecular biology 聚 合 酶 链 式 反 应 ( Polymerase chain reaction, PCR) 是 20 内 切酶 的 酶 切 位点 5, 有 利 于定 向 克 隆 , 加 入 的 酶 切 位点 不 世纪 后 期发 展起 来 的一 种体 外 扩增 特异
6、 DNA 片 断的 技术 , 能 与引 物内 部形 成 互补 结构 6, 并且 所选 择 的 酶 切位 点 尽量 具 有快 速 、 简 便及 高度 敏 感等 优点 , 能极 大 地缩 短目 的 基因 为 多克 隆 位 点 的中 间 酶 切 位点 , 最 好 载体 其 他 地 方 无该 酶 扩 增 时 间 。 因 此 , 其 一 直 是 生 物 学 者 们 致 力 于 构 建 cDNA 文 库 、 基 因 克 隆 以及 表 达 调 控研 究 的 必要 前 提 和 基础 。 近 年 来 , 该技 术 在相 关领 域 得到 了广 泛应 用 , 并大 大推 进 了分 后研 究该 基因 的后 续实 验奠
7、 定基 础 。 子生 物学和相关 领域的研究 和发展 。 众所周知 , 引物设 计是影 通 常情 况 下 , 研究 者 进 行 引物 设 计 的 基 因 涉 及 到很 多 响 PCR 试 验 的 重要 参 数 之一 。 目 前 , 虽然 引 物 设 计 软件 的 功 能 都非 常 完 善 , 但 是 关 于 计算 机 引 物设 计 程 序 的文 献 还 基 因又 包括 多个 基 因 , 都 必须 综合 分 析 。 以 上便 是研 究 具体 不多 , 初学 者 具体 操作 起 来还 是会 觉得 比 较复 杂 , 该 文 拟对 基 因的 目 的 及 意义 , 即 所 设 计引 物 的 基因 必 须
8、 要 在 相关 领 引物 设计 的原则 和软件 的使 用方法 进行 深入地 探索 和分析 。 域有 自身 的研 究和 应用 价值 。 1 具体 基因 引物 设计 的目 的和 意义 2 引物 设计 总体 概述 在 准备 基 因 引物 设 计 前 , 要非 常 清 楚 地 了 解 其 研究 的 并 不是 所 有 研究 都 有 可 以借 鉴 的 通 用 基 因 。 由 于 所探 宗 旨和 意义 , 首先 要查 阅 大量 的文 献 , 明 确 该基 因的 相 关理 索 的科 学问 题 不同 , 突破 点和 侧 重点 也就 不 一样 , 往往 就需 化特 性 。 以 研究 银杏 的顺 式 -异戊 烯 基
9、转 移酶 ( cis-prenyltran 要 根据 不 同 的研 究 目 的 和意 义 进 行 引物 设 计 。 如 研 究植 物 sferase CPT 成 的第 一 个 关 键酶 , 分 别 从法 尼 基 焦 磷酸 ( Farnesyl pyropho sphate, FPP) 或牦牛 儿基牦 牛 儿基 焦磷 酸 ( Geranylgeranyl pyr- ophosphate, GGPP) 形 成 聚 戊 烯 醇 、 甾 醇 、 类 胡 萝 卜 素 、 叶 绿 CPT Oh 南 芥 中 分 离 和 鉴 定 了 CPT, 而 NCBI 中 尚 无 银 杏 CPT 序 列 的记 载 , 通
10、过 从 银杏 叶 中 克隆 CPT 进 行 基 因表 达 调 控 和功 能 分 析研 究 , 对 于探 讨 银 杏 聚戊 烯 醇 的合 成 代 谢 具有 重 要 的 意义 。 其 次 , 在 进 行 引物 设 计 之 前 必 须 弄 清 楚 是 否 要 进一 步 用于 克隆 或 表达 。 若要 用于 克隆 , 引物 5端 最好 加 上限 制性 要 涉及 引物 设计 软 件 。 通 过搜 集大 量 的信 息资 源 , 当 前 进行 厅高校 自然科 学基 金资助 项目 ( 08KJD220002 ); 扬 州大 学 科技创新培育基金资助项目 ( 2007CXJ018, 2009CXJ030)。 n
11、cbi.nlm.nih.gov)、 DDBJ ( http /www.ddbj.nig.ac.jp: )、 EMBL http( : * 通讯作者 fhcrc.org/blocks/makeblocks.html 或 http: /blocks.fhcrc.org/block 收稿日期 2011-07-04 mkr/makeblocks.html)、 CodeHop( http: /blocks.fhcrc.org/blocks/ 48 * 1 2 3 的 多倍 化与 杂 交 , 就 需要 设计 单拷 贝 核基 因的 引 物 ; 而 研究 多 基因 家 族 进化 , 就 需 要 设计 可 以
12、扩 增这 一 基 因 家族 不 同 7 进行 引物 设计 的主 要数 据库 和生 物软 件 4 目前 , 进行 引物 设 计时 模板 选 择有 2 种 情 况 : 一 种 是扩 增 已知 基 因 , 需 要在 GenBank 数 据 库 中 搜索 相 同 物种 该 基 因的 DNA 或 者 mRNA 作 为模 板 来设 计引 物 ; 另 一 种是 扩增 未 知基 因 , 需 根据 比较 基 因组 定位 的原 理 , 选择 研究 深 入的 高 等动 植 物 保 守的 功 能 基 因的 DNA 或 者 mRNA 序 列 为模 8 虽然 引 物设 计模 板 选择 有很 多 , 但 是无 论 何种 情
13、 况 , 都 基金项目 江 苏省自 然科学基 金 资助 项目 ( BK2008213); 江 苏省教 育 引物设 计 的 国 际 三 大 核 酸数 据 库 分 别 为 NCBI( http: /www. 作者简介 尤超 ( 1987-), 男 , 安徽灵璧人 , 在读硕士研究生 。 研究方向 : /www.ebi.ac.uk/embl BlockMaker http /blocks. 银杏 次生代谢调控 。 尤 超等 : PCR 引物 设计 方法 综述 获取序列 ( NCBI, Gramene, EBI 等 ) codehop.htm)、 clustalW2 ( http:/www.ebi.a
14、c.uk/Tools/clustalw2/ index.html)、 VectorNT I Suit、 Dnasis Omiga、 Dnastar、DNAMAN、 Oligo6.0 等 9。 另外 , 笔者 通 过搜 集资 料发 现 , 现在 引 物 设计 还 可以直 接登录 http: / 在 SciTools 的 下 拉 菜 单 中 直 接 选 择 PrimerQuest, 然 后 弹 出 相 关 的 操 作 界 面 , 最后 研 究 者 根据 所 研 究的 目 的 和 意义 进 行 针 对性 的 计 算机 引物 设计 程序 操作 。 设 计引 物 的 软件 一 般 都 具有 引 物 自
15、动 搜 索 功能 , 不同 软 件 侧重 点 有 所不 同 。 因 此 , 自动 搜 索 的结 果 也 不 一样 。一 般 以 Premier Primer 5.0 功 能 最 强且 方 便 使用 , 其 次 是 Oligo 6.0, 其 他 软件 如 Vector NT I Suit、 Dnasis Omiga 和 Dnastar 等 都 带有 引物 自 动搜 索功 能 , 但 搜索 结 果都 不是 十 分理 想 。当 然 , 要 想得 到 效果 很好 的 引物 , 在自 动搜 索 的基 础上 还 要辅 以人 工分 析 。 2.2 设计 原则 虽 然引 物 设 计软 件 种 类 很多 , 但
16、 其 引 物 设 计 必 须 遵循 以下 基本 原则 。 2.2.1 引 物 与 引 物 之 间 避 免 形 成 稳 定 的 二 聚 体 或 发 夹 结 构 , 引物 与 模 板 的序 列 要 紧密 互 补 。 引 物 设计 中 , 特 别需 要 判 断 引物 互 补 配对 情 况 是 否影 响 模 板 与引 物 的 结合 , 这 需 要估 计模 板与 引物 结合 及引 物配 对结 合 的自 由能 。 A、 T 由 2 个 氢 键连 接 , G、 C 由 3 个 氢 键 连接 。 一 般 来 说 , 出 现 3 个 碱 基的 序列 互补 便有 些危 险 , 尤 其在 引 物 3末 端 。 若
17、3末 端出 现 3 个 碱基 的 序 列互 补 或碱 基 为 GC 的 2 个碱 基 的 序 列互 补 , 只 好将这 个引 物放 弃 , 重 新设 计 6。 2.2.2 在 选 择 用 来 扩 增 不 同 物 种 DNA 的 引 物 时 , 应 避 开 mRNA 的 5和 3末 端非 翻 译 区序 列 。 不同 物 种 mRNA 的 5 和 3末 端 非 翻 译 区 序 列可 能 没 有 任 何 的 同源 性 11, 如 果 选 择 的不 同物 种 DNA 序列 同 源性 非常 低 , 那么 就 无法 保 证获 得 一 段或 几 段 高度 保 守 的 序列 , 将 会 为引 物 设 计 带
18、来很 大 的 困扰 , 特 别 是在 BLAST 比 对 和 Primer Premier 5.0 软 件进 行 评价 分析 时 , 各 项 参数 指标 将会 远 远达 不到 要求 , 无 法充 分保 证引物 设计 的高度 敏感 性和特 异性 , 更 会为 后期 的 RT- PCR 试 验带 来诸 多麻 烦 。 2.2.3 不 同类 型 引 物 设 计 的 特别 原 则 。 特 异 性 引 物 的 错配 率 很 低 , 甚 至为 零 , 其中 , RT-PCR 引 物最 好跨 过 1 个以 上的 内含 子 序列 ; 非特 异性 引 物的 扩增 位点 数 要在 合适 范 围内 ; 简并 性引 物
19、的 简并 性要 合适 等 。 2.3 具体 设计 方法 引物 设计 流程 见图 1。 2.3.1 NCBI 搜 核苷 酸 序 列 。 登 录 www.ncbi.nlm.nih.gov/Gen- Bank, 可以 从 GenBank 中 获取 基 因序 列作 为 模板 。 根据 试验 要求 来 确定 需要 扩 增的 DNA 序 列 , 并 知 道 其 编 码结 构 基因 区 序列 。 具 体 方法 如下 : 在 Search 对 话框 中选 择 Nucleotide, 在 对 话框 中 填 入所 要 查 找 的 Nucleotide 名 称 , 如 输 入 CPT, 点 击 Go 即 得 到 与
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