转化及筛选技术ppt课件.ppt

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1、基因工程的操作过程切接转增检6、重组DNA分子的转化、筛选6.1、概述：转化 (transformation) ： 严格地说是指感受态（即受体细胞最易接受外源DNA片段而实现转化的一种特殊生理状态）的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。转染 (transfection)：则是专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。 带有外源DNA片段的重组DNA分子在体外构成之后，需要导入适当的寄主细胞进行繁殖，才能够获得大量的纯一的重组DNA分子。这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 将外源重组DNA分子导入受体细胞的途径，包括转化、转染、显微注射和电穿孔等不

2、同方式；转染和转化主要适用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞；而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。 6.2、细菌转化过程：感受态的形成。转化因子的形成DNA结合蛋白。转化因子的吸收。整合复合物前体的形成。转化因子单链DNA的整合同源重组。6.3、转化原理与技术CaCl2转化法 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的生理状态叫做感受态 。CaCl2转化法：大肠杆菌感受态细胞的制备：100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集

3、菌体。用10 ml 冰浴的100mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体。用1 ml 冰浴的100 mM CaCl2溶液悬浮菌体。 冰浴放置12 - 24小时，备用。大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组DNA连接液，混匀；冰浴放置半小时； 在42保温 1.5 分钟（热脉冲）；快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟；加入1 ml 新鲜培养基，于37培养 1 小时（扩增）；涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。CaCl2转化法：原生质体转化法: 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原

4、生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子。 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化。 原生质体的转化步骤： 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液），并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。 细菌原生质体的制备： 取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀。转化原生质体：原生质体的再生：

5、 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁，再生需在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。电穿孔转化 将待转化的质粒或DNA重组分子连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。 6.4、受体细胞l各种基因工程受体细胞的特性：大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程最重要的原核受

6、体菌。枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培养简单，不产内毒素。遗传欠稳定，载体受体系统欠完备。酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定。内源性蛋白产物种类繁多且含量高。适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核受体菌。昆虫细胞（家蚕） 外源基因表达量高，繁殖较快，培养成本低廉，遗传稳定。适用于真核生物基因的高效表达。哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞，CHO） 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统。细胞培

7、养条件苛刻，生长缓慢 。适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体。植物细胞（拟南芥、烟叶） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用。遗传操作繁琐。适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良。 l受体细胞应具备的条件限制性缺陷型：外切酶和内切酶活性缺陷（hsdR-）。 重组整合缺陷型：用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA- 、recB-，recC- ）。 转化亲和型：具有较高的转化效率。具有与载体选择标记互补的表型；感染寄生缺陷型：防止重组细菌扩散污染。6.5、l

8、噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基 中培养至OD600 = 0.5；吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟；转染裂解： 加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。6.6、转化率转化率的定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。 由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，接纳DNA的受体细胞个数，即克隆数（在筛选时，未接纳

9、载体或重组子的受体细胞不生长）。转化率的定义 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子。也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞。 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA。 转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构

10、象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。 插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。转化率的影响因素：转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA 转化方法：Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA 原生质体转化 105 - 106 / mg DNA l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA 转化率的影响因素：受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如

11、：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。 7、重组子的筛选和鉴定（检）常用重组子筛选方法直接筛选间接筛选DNA鉴定载体筛选翻译产物：Western blotting转录产物：Northern blotting其它方法：报告基因质粒载体的抗性标记筛选重组子大小的鉴定重组子酶切图谱鉴定鉴定DNA序列分析质粒载体的a-互补筛选原位杂交 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。转化子重组子目的重组子u抗药性筛选法ROPROISal IBamH ITcrPvu

12、 IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr基本原理：插入失活 pBR3224363 bpori例：将外源DNA片段插在BamHI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs 基本操作： n先将转化液涂布含有Ap的平板；n再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上 ；n在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为目的重组子。ApAp + Tc影印挑选u显色筛选法显色筛选法的基本原理： 载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色

13、反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。正选择标记 lacZ 的显色原理： a-互补pUC18/19PlaclacZMCS -半乳糖苷酶N端的a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN（5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷）显色底物X-gal-半乳糖苷酶C端诱导物IPTG; X-gal显色筛选法显色筛选法的基本操作： pUC18AprlacZoriAp + X-gal重组子（Apr + lacZ-） 将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之失活，此时重组子呈Apr、lacZ-，菌落呈白色；而非重组子则呈Apr、la

14、cZ+，菌落呈蓝色。 u限制性酶切图谱法： 限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb区分重组子与非重组子用BamHI酶切转化子质粒DNA，电泳观察酶解产物片段： 重组子：2.7 kb + 4.0 kb 非重组子： 2.

15、7 kb全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子用EcoRI酶切转化子质粒DNA目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb 或者： 1.0 kb + 5.7 kb用PstI酶切转化子质粒DNA目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb 或者： 0.8 kb + 5.9 kb限制性酶切图谱法全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIA

16、prlacZoriBBE4.0 kb2.0 kb2.0 kb区分目的重组子与非目的重组子对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0 kb和2.7 kb两条带。2.7 kb2.0 kbEu菌落原位杂交法 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。菌落原位杂交法的基本操作：影印u用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板； 洗涤杂交感光u用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜； u用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜；u80烘干固定影印薄膜； u薄

17、膜置于含有探针的杂交溶液中保温； u用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜 ；u用X光胶片覆盖薄膜感光。u外源基因产物检测法：蛋白质生物功能测定法淀粉酶目的基因的鉴定： 将难溶于水的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组子可其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈。 如果透明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，易于辨认。蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定。抗菌素抗性基因的鉴定： 抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，

18、只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子。 在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞后再筛选抗性菌落。u克隆DNA序列检测目的基因测序：Sanger双脱氧末端终止测序法和Maxam-Gilbert化学降解法。抗菌素抗性基因的鉴定： 目的重组子 诱导抗性 抽取重组质粒再次转化外源基因产物检测DNA结合蛋白编码基因的鉴定： 影印用聚乙烯薄膜影印裂解平板 洗涤杂交感光轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 80烘干固定影印薄膜 与探针溶液中杂交 洗涤、干燥、感光 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板 聚乙烯膜探

19、针选用能与 目标蛋白特异 性结合的DNA 片段 外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法杂交释放转译鉴定： 合合并并 变变性性 挂挂柱柱 制制备备 上上样样 淋淋洗洗 洗洗脱脱 翻翻译译 测测活活 重组重组DNA 单链单链DNA mRNA 杂交的杂交的mDNA 蛋白质蛋白质 蛋白质蛋白质 无细胞体外翻译系统：麦胚提取物、网织红细胞提取物 A DNA的体外重组（切与接）基因工程的操作过程同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接粘性末端的更换人工粘性末端的连接重组率同种内切酶生产的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTT

20、AAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGAT

21、CACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT不同粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstI3 T4-DNA pol切平5 CG5 GCKlenow补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC人工

22、粘性末端的连接 5突出末端5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5Klenow补平Klenow补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCC

23、CCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamH IBamH IEcoR IBamH I人工粘性末端的连接 3突出末端CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火Pst IPst IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGC

24、AGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I人工粘性末端的连接 平头末端C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTT

25、TTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT粘性末端的更换BamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseKlenow补平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5 5EcoR IGGAATTCCCC

26、TTAAGGEcoR I linker重 组 率重组率的定义 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。重 组 率提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T

27、-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶重 组 率提高重组率的方法加装同聚尾末端： CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火C3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGT

28、ACGKlenow克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：逆转录酶介导的反转录标记3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT 5mRNA反转录酶Mg2+ dNTP + pppdATP（a a-32P-dATP）5TTTTTTTTTTT5mRNA3cDNA3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT5TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGA克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：DNA聚合酶介导的缺口前移标记5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-

29、G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 Mg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（a a-32P-dATP）5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 DNase IDNA pol I克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：ABC荧光标记GCTTGAGCAGTAACCTG荧光胺Biotin 生物素Avidin生物素结合蛋白烷烃连接臂克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：ABC显色酶标记GCTTGAGCAGTAACCTG显色酶Biotin 生物素Avidin 生物素结合蛋白烷烃连接臂生色底物颜色产物克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：地高辛系统标记dUTP-连接臂-甾醇半抗原digoxigenin DIG抗体-显色酶交联复合物