HPLC分析方法的建立与开发ppt课件.ppt

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1、建立分析方法建立分析方法色谱分离度与分离性能色谱分离度与分离性能HPLC分离的机理分离的机理分离是一个物理的过程。色谱工作者关心的基本问题色谱工作者关心的基本问题 - 色谱峰之间的分离度色谱峰之间的分离度totRAmAUtimetRBR = R = 分离度分离度t tRA RA = = 组分组分A A的保留时间的保留时间t tRBRB= = 组分组分B B的保留时间的保留时间w = w = 峰的基线宽度峰的基线宽度w w1/21/2= =半峰宽半峰宽)()(2BARRWWttRAB)()(176.12121BABWWttRARR分离度值分离度值等梯度洗脱的基本分离度公式等梯度洗脱的基本分离度公

2、式N: : 总的理论塔板数总的理论塔板数; ; 柱效柱效k: k: 容量因子容量因子 ( (保留因子保留因子), ), 色谱峰的保留作用色谱峰的保留作用 ：色谱峰的相对分离程度色谱峰的相对分离程度; ; 选择性作用选择性作用影响分离度的因素影响分离度的因素容量因子对分离度的影响容量因子对分离度的影响容量因子容量因子 - - 流动相组成的影响流动相组成的影响选择性选择性影响选择性的参数影响选择性的参数降低增加 较弱的溶剂较强的溶剂异丙醇/水甲醇/水乙腈/水C-2C-18容易超载不容易超载改变流动相组成改变流动相组成改变固定相改变固定相有机成分含量低的固定相有机成分含量低的固定相 有机成分含量高的

3、固定相有机成分含量高的固定相色谱柱温度对分离度的影响色谱柱温度对分离度的影响柱效柱效计算柱效计算柱效典型的流速值典型的流速值4.61-23.00.4-0.82.10.2-0.41.00.05-0.09柱内径柱内径 mm(5um 粒度粒度)mL/minflow rate2 =i.d.2i.d.12flow rate1柱外体积的影响柱外体积的影响10 L20 LTime, min.2.1 x 150 mmF = 0.2 mL / min.样品体积样品体积连接管路的体积连接管路的体积检测器体积检测器体积 检测器电子线路的时间常数检测器电子线路的时间常数所需分离度与柱长匹配所需分离度与柱长匹配峰对称性

4、峰对称性提高分离度提高分离度增大 k增加选择性提高柱效分离度与分离度与 k, n 和和 的关系的关系液相色谱流动相及固定相液相色谱流动相及固定相流动相流动相 与与GCGC流动相不同，流动相不同，HPLCHPLC流动相为溶剂，它既有流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一起参予对组分的竞争，因运载作用，又和固定相一起参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。此溶剂的选择对分离十分重要。1 1、 理想的溶剂应有下列特性理想的溶剂应有下列特性 1 1）化学稳定性好，）化学稳定性好，与固定相不互溶、不发生反应与固定相不互溶、不发生反应2 2）必须和检测器相适应必须和检测器相适应 使用使用UVU

5、V检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长 使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别折光率有较大差别3 3）对待测物具一定极性和选择性）对待测物具一定极性和选择性4 4）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；止波长增加；尽量避免使用有显著毒性的溶剂尽量避免使用有显著毒性的溶剂5 5）适宜的粘度）适宜的粘度 粘度过高，柱压增加粘度过高，柱压增加 过低（例：过低（例：戊烷、乙醚等），易产生气泡，易产生气泡2 2、溶剂的极性、溶剂的极性 溶剂的极性强

6、弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，表示溶剂的洗脱能力越大。表示溶剂的洗脱能力越大。序号溶剂紫外波长极限（nm）序号溶剂紫外波长极限（nm）1异辛烷1979氯仿2452正己烷19010二氧六环2153甲基叔丁基醚21011丙酮3304苯27812乙醇2105二氯甲烷23313醋酸6正丙醇24014乙腈1907四氢呋喃21215甲醇2058乙酸乙酯25616水2003 3、流动相的选择、流动相的选择4 4、梯度洗脱、梯度洗脱 特点：可以缩短总的特点：可以缩短总的色谱周期，提高分离效色谱周期，提高分离效能，改善峰形，减少拖能，改善峰形，减少拖尾，

7、可以增加灵敏度，尾，可以增加灵敏度，会引起基线漂移会引起基线漂移固定相固定相化学键合固定相化学键合固定相方法方法：通过化学反应将有机分子键合在载体表面形成：通过化学反应将有机分子键合在载体表面形成柱填柱填（约有约有3/43/4以上分离问题是在化学键合固定相上进行以上分离问题是在化学键合固定相上进行）特点：特点：稳定、流失小、适于梯度淋洗稳定、流失小、适于梯度淋洗分离机理：分离机理：兼有吸附、分配两种分离模式。化学键合兼有吸附、分配两种分离模式。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。合相来说，以分配机理为主。 载

8、体载体主要是硅胶（表面有硅醇基）主要是硅胶（表面有硅醇基）, ,特点为：特点为： 可以制备成粒度分布窄的多种粒度可以制备成粒度分布窄的多种粒度 机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床 长期高压操作下不变形长期高压操作下不变形 反压较低、柱寿命长反压较低、柱寿命长 较其它材料制成的柱有更高的柱效较其它材料制成的柱有更高的柱效 适用于小分子、大分子的分析和制备适用于小分子、大分子的分析和制备 高高pHpH值下会分解（值下会分解（pHpH8 8）键合方法：键合方法： （l l）硅酯化（）硅酯化（Si-O-RSi-O-R）键合固定相键合固定相 （2) 2)硅氮

9、型（硅氮型（= =Si-N=Si-N=）共价键合固定相共价键合固定相 （3 3）硅烷化）硅烷化（ Si-O-Si-RSi-O-Si-R）键合固定相键合固定相使用键合固定相应注意的问题使用键合固定相应注意的问题 硅胶键合相的稳定性硅胶键合相的稳定性 键合相色谱分离的重现性键合相色谱分离的重现性 键合相色谱分离的选择性键合相色谱分离的选择性 键合相色谱柱的再生键合相色谱柱的再生 化学键合相色谱法化学键合相色谱法正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱反相色谱的定义：反相色谱的定义：在非极性的固定相上，用极性较大在非极性的固定相上，用极性较大的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：反的液体作流动相进行

10、物质分离分析的方法。即：反相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性正相色谱的定义：正相色谱的定义：在极性的固定相上，用极性较小的在极性的固定相上，用极性较小的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：正相液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：正相色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱的差别：正相色谱和反相色谱的差别：正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱固定相极性固定相极性大大小小流动相极性流动相极性小至中等小至中等中至大中至大组分流出顺序组分流出顺序极性小的组分先流极性小的组分

11、先流出出极性大的组分先流极性大的组分先流出出流动相极性增大流动相极性增大保留时间变小保留时间变小保留时间变大保留时间变大分离组分分离组分油溶性或水溶性的油溶性或水溶性的极性和强极性化合极性和强极性化合物物非极性、极性或离非极性、极性或离子型化合物子型化合物正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性：待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系正相键合相色谱法正相键合相色谱法 固定相：固定相：正相色谱中采用正相色谱中采用

12、极性极性键合固定相，是键合固定相，是把全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活把全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量化处理制成表面含有大量硅羟基硅羟基的载体后，的载体后，再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反应，生成表面具有应，生成表面具有胺基、腈基、醚基胺基、腈基、醚基的极性的极性固定相。固定相。 流动相流动相： 在非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适在非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），分离极量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），分离极性化合物。此时，组分的分配比性化合物。此时，组分的分配比k k

13、值随其极性的值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。 主要用于分离主要用于分离异构体异构体、极性不同极性不同的化合物，特的化合物，特别适用于分离别适用于分离不同类型的化合物不同类型的化合物。反相键合相色谱法反相键合相色谱法 采用采用非极性键非极性键合固定相合固定相, ,是把全多孔是把全多孔( (或薄壳或薄壳) )微粒硅胶载体微粒硅胶载体, ,经酸活化处理后经酸活化处理后, ,和含有和含有烷基链烷基链或苯基或苯基的硅烷化试剂反应的硅烷化试剂反应, ,生成表面具有烷基生成表面具有烷基( (或苯基或苯基) )的非极性固定相，如的非极性固定相，如C1

14、8C18、C8C8流动相：流动相： 流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物等低极性化合物v若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物，可用于分离极性化合物v若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等 具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点具有柱效高，能获得无拖

15、尾色谱峰的优点硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C181-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。分析方法建立分析方法建立分析时要了解的情况分析时要了解的情况v想办法得到各种信息想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法的分

16、析方法查文献和方法，如查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-CA,AA,AOAC,EPA-仪器制造商的文献仪器制造商的文献v充分了解自己的样品充分了解自己的样品v对色谱柱有足够的了解对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法掌握分离机理，自己开发方法分析时要了解的情况（续分析时要了解的情况（续1）v灵敏度的要求有多高灵敏度的要求有多高? ? v样品的本底是否很复杂样品的本底是否很复杂? ? v有多少组份要分析有多少组份要分析? ? v对分析的精确度、准确度等有多高要求对分析的精确度、准确度等有多高要求? ? v是否因是日常检验，而要求方法容易使用是否因是日常检验，而要求方法容易使用

17、? ?分离分离(制备制备)时要了解的情况时要了解的情况v要分离（即制备）的样品量有多大要分离（即制备）的样品量有多大? ? v要分离的组份在样品中的含量很高要分离的组份在样品中的含量很高? ? 还是微量还是微量? ? v是否需要保持生物活性是否需要保持生物活性? ? v对分离产物纯度的要求有多高对分离产物纯度的要求有多高? ? v纯度或活性的鉴定如何完成纯度或活性的鉴定如何完成? ?什么化合物参数能用于分离什么化合物参数能用于分离 ? 分子量不同分子量不同/ /MW 2000 MW 2000 凝胶渗透凝胶渗透 / / 凝胶过滤凝胶过滤离子化分子离子化分子 离子对离子对/ / 离子交换离子交换

18、极性不同极性不同 吸附吸附/ / 反相色谱反相色谱 同系物同系物 / / 苯系物苯系物 反相反相 中性、酸和碱的混合物中性、酸和碱的混合物反相反相 生物分子生物分子 亲和亲和/ /HIC/HIC/凝胶过滤凝胶过滤/ /反相反相 立体异构体立体异构体 吸附吸附 手性化合物手性化合物 手性色谱手性色谱固定相和流固定相和流动相选择动相选择一般的具体步骤一般的具体步骤v先用一根短的色谱柱先用一根短的色谱柱v用相对较高的流速用相对较高的流速v使用尽可能纯度高的标准品使用尽可能纯度高的标准品v先用高强度的洗脱液先用高强度的洗脱液v调节调节k k 值改变保留值值改变保留值v调节调节 值改变选择性值改变选择性

19、v调节柱长度改变柱效及分离速度调节柱长度改变柱效及分离速度记住记住 每次改变一个参数每次改变一个参数使用文献方法注意点使用文献方法注意点v色谱柱填料的种类、品牌是否相同色谱柱填料的种类、品牌是否相同? ?v注意文献方法的流动相注意文献方法的流动相是否损害色谱柱是否损害色谱柱? ?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相如色谱填料品牌不同，需要调整流动相v注意色谱柱的规格：内径、柱长注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量需要调整流速、进样量v注意梯度条件注意梯度条件v了解系统的滞后体积（梯度）了解系统的滞后体积（梯度）色谱方法转换色谱方法转换v如果没有与文献或要求相近的色谱柱如果没有与文献或

20、要求相近的色谱柱转换进样量转换进样量转换流速转换流速长度内径，进样量初始初始现在现在初始LDLDLDLoadLoad22)()()(内径流速初始现在初始DDDFF22)()()(常规样品分离的系统方法常规样品分离的系统方法总的指导原则总的指导原则v改变可以明显改善选择性的条件改变可以明显改善选择性的条件v避免会影响方法普适性的实际问题避免会影响方法普适性的实际问题v减少必要的实验次数，尽可能地利用计算机模拟减少必要的实验次数，尽可能地利用计算机模拟v选择适用于各种常规试样的实验，以便采用同样选择适用于各种常规试样的实验，以便采用同样的方法建立未知样品（离子的或中性）的的方法建立未知样品（离子的

21、或中性）的HPLCHPLC分析方法分析方法v先做简单易行的先做简单易行的 实验（改变色谱柱、改变实验（改变色谱柱、改变pHpH、使用复杂的混合溶剂等属于比较难做的条件）使用复杂的混合溶剂等属于比较难做的条件）反相反相HPLCHPLC分离的总体方案设计分离的总体方案设计1 1、确定样品是属于常规的还是特殊的、确定样品是属于常规的还是特殊的 特殊样品包括：特殊样品包括： 无机离子无机离子 对映体对映体 生物分子生物分子 合成的高分子合成的高分子 碳水化合物碳水化合物 异构体异构体 2 2、选择分离条件，进行第一次分离、选择分离条件，进行第一次分离分离变量分离变量最佳的初始选择最佳的初始选择柱填料柱

22、填料C C8 8 或或 C C1818柱结构柱结构15cm15cm* *4.6 mm 4.6 mm 或或 25cm25cm* *4.6 mm4.6 mm，5 5 m m流速流速1.0 ml/min1.0 ml/min（或（或2.0 ml/min2.0 ml/min）流动相流动相乙腈乙腈水（中性样品）水（中性样品）乙腈乙腈-缓冲液（离子型样品）（缓冲液为缓冲液（离子型样品）（缓冲液为25-25-50mM50mM磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，pH 2pH 23 3）对初始试验：对初始试验：5 100%B5 100%B梯度梯度温度温度常温常温进样量进样量50 50 LL（20 L 20 L ）选择流动相选

23、择流动相 在反相色谱中常用水在反相色谱中常用水/ /乙腈乙腈 pHpH的选择思路的选择思路 选低选低pHpH可以使柱硅羟基质子化并可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性降低其色谱活性 低低pHpH与常见酸碱官能团的与常见酸碱官能团的pKapKa值值相差较远，组分在此条件下的相差较远，组分在此条件下的t tR R受受pHpH变化影响小变化影响小 初期应初期应避免使用避免使用三乙胺和离子对三乙胺和离子对试剂等添加剂试剂等添加剂 准备标准样品准备标准样品 过滤样品过滤样品 安装色谱柱安装色谱柱 冲洗柱，平衡冲洗柱，平衡 平衡检测器平衡检测器 进样进样 分析结果分析结果第一次第一次 HPLC 运行运行第

24、一次第一次 HPLC 运行运行选择逐步方法开发步骤选择逐步方法开发步骤用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降低洗脱液强度低洗脱液强度尝试运行梯度尝试运行梯度第一次第一次 HPLC 运行运行 无峰无峰/ /响应响应 分离度差的峰分离度差的峰第一次运行得到的结果可能第一次运行得到的结果可能: : 检测方法不正确检测方法不正确 浓度太稀浓度太稀提高进样浓度，或者在无色提高进样浓度，或者在无色谱柱的条件下注射少量样品谱柱的条件下注射少量样品改变流动相改变流动相优化系统优化系统得到了色谱峰得到了色谱峰 - - 是是 - - 否否检查检查 HPLCHPLC系统系统

25、3 3、做初次运行并根据谱图将样品分类、做初次运行并根据谱图将样品分类 0.5k20 0.5k20 等度洗脱可行，超出此范围等度洗脱可行，超出此范围等度洗脱可行的样品等度洗脱可行的样品建议用梯度洗脱的样品建议用梯度洗脱的样品反相保留太弱的样品反相保留太弱的样品改变改变pHpH、加入离子对试剂、改变、加入离子对试剂、改变柱子、改用正相色谱柱子、改用正相色谱强保留样品强保留样品用非水反相或正相条件用非水反相或正相条件复杂样品复杂样品4 4、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等度运行的最佳度运行的最佳B%B%5 5、评价第二次运行中峰的质量、评价第二次运

26、行中峰的质量- -柱效、峰宽、峰形柱效、峰宽、峰形 峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、pHpH、添加剂等）、添加剂等） 运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复的保留时间的保留时间6 6、 对等度方法，可以改变对等度方法，可以改变ACN%ACN%来改善峰间距和来改善峰间距和分离度分离度 若有必要，若有必要， ACNACN改为改为MeOHMeOH，并根据峰间距和，并根据峰间距和分离度优化分离度优化MeOH%MeOH% 可以进一步混合可以进一步混合ACNACN和和MeOHMeOH成为三元溶剂系成为三元

27、溶剂系统，并优化统，并优化7 7、若、若6 6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件性和分离的附加条件8 8、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离度峰间距和分离度结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件加条件9 9、对梯度方法，改变初始和最后的、对梯度方法，改变初始和最后的B%B%、梯度变化速、梯度变化速度、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间度

28、、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间1010、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间等度分离方法等度分离方法反相色谱的方法开发反相色谱的方法开发v开发过程实例开发过程实例色谱条件色谱条件v色谱柱：色谱柱：C C1818，4.6mm4.6mm15cm15cmv流动相：乙腈流动相：乙腈/ /水，不同的溶剂强度，水，不同的溶剂强度，60/4060/40、50/5050/50、40/6040/60，由强渐弱，由强渐弱 （或走梯度）（或走梯度）v流速：流速：1ml/min

29、1ml/min样品：样品： 对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben)(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben)(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben(Butyl Paraben)改变容量因子改变容量因子 K K60/4050/5040/60(改变比例改变比例) 对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸甲酯 对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丙酯 对羟基苯甲酸丁酯对羟基苯甲酸丁酯通过改变通过改变流动相比例流动相比例改变选择性改变选择性改变选择性改变选择性v通过改变通过改变流动相组

30、成流动相组成改变选择性改变选择性同样强度的不同溶剂同样强度的不同溶剂62:38/42:58/72:28/2322，OHCNCHOHMeOHOHTHF固定相优化：改变色谱柱固定相优化：改变色谱柱0246810120246810121234567891012456789103C-18C-8Optimization1010种巴比妥药物的分离（等梯度）种巴比妥药物的分离（等梯度）保留时间 (min)3.14 相对吸光度4.555.746.447.117.7410.7611.7912.631 巴比妥2 阿洛巴比妥3 阿普比妥4 苯巴比妥5 异丁比妥6 环戊巴比妥7 布他比妥8 海索比妥9 异戊巴比妥10

31、 甲苯比妥25% 乙腈12456789101112313优化流动相优化流动相 - - 困难的分离困难的分离010203040506070 80901000204060801000201040305060708090100乙腈乙腈/ /水水甲醇甲醇/ / 水水四氢呋喃四氢呋喃/ /水水甲醇1467253四氢呋喃乙腈1. 1.从甲醇从甲醇/ /水开始，优化溶剂组成水开始，优化溶剂组成以使所有色谱峰在合理的以使所有色谱峰在合理的 k k 范围范围流出流出. .2. 2.选择洗脱强度相等的乙腈选择洗脱强度相等的乙腈/ /水混水混合流动相进行下一次分析合流动相进行下一次分析. .3. 3.用四氢呋喃用四

32、氢呋喃/ /水流动相重复分析水流动相重复分析4. 4.按比例混合等强度流动相再进按比例混合等强度流动相再进行进样分析行进样分析 优化优化三种流动相的比较三种流动相的比较1 巴比妥1111.81.61.62 阿洛巴比妥2221.21.11.13 阿普比妥3441.11.11.14 苯巴比妥4331.2 1.41.35 异丁比妥5551.1116 话环戊巴比妥6661.11.11.17 布他比妥7791.51.21.18 海索比妥8971.111.19 异戊巴比妥910101.11.41.810 甲苯比妥108825%乙腈35%甲醇21%异丙醇洗脱顺序洗脱顺序 选择性离子型化合物的分离方式离子型化

33、合物的分离方式v使用离子交换柱使用离子交换柱离子交换法离子交换法主要用于主要用于“强强”阴、阳离子阴、阳离子v使用反相柱使用反相柱v通过改变流动相的通过改变流动相的pHpH值，使样品成中性值，使样品成中性v加入加入“对离子对离子”，使样品呈中性，使样品呈中性v离子型化合物在反相色谱柱上不保留离子型化合物在反相色谱柱上不保留v改变流动相的改变流动相的pHpH值，抑制样品离子的电离值，抑制样品离子的电离v适用于弱酸性化合物的分离适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的降低流动相的pHpH值，使样品降低离子化值，使样品降低离子化使用硅胶基质使用硅胶基质C C1818填料填料v使用条件应在填料基质的范围内

34、使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的硅胶柱的pHpH在在2-82-8内内如果：如果：一些酸在一些酸在pHpH低于低于2 2时还保持离子化时还保持离子化一些碱在一些碱在pHpH高于高于7 7时还保持离子化时还保持离子化v可以有以下的选择可以有以下的选择离子交换色谱离子交换色谱使用聚合物反相柱，在使用聚合物反相柱，在pHpH高于高于7 7时用离子抑制法时用离子抑制法使用使用“离子对色谱法离子对色谱法”分离弱离子化化合物的初始实验条件分离弱离子化化合物的初始实验条件水相缓冲液水相缓冲液 / /乙腈乙腈可变可变 (k = 0.5(k = 0.520)20)分离变量分离变量初始选择初始选择尺寸尺寸粒度粒

35、度键合相键合相15 (15 (或或 25) x 0.46 cm25) x 0.46 cm5 5 或或 3.5 3.5 m mC C18 18 或或 C C8 8溶剂溶剂 A A 和和 B B（% B% B）温度温度体积体积质量质量4040C C 20 20 L L 25 1.51.5的的条件下，柱效的条件下，柱效的变化对采用峰面变化对采用峰面积定量的定量分积定量的定量分析结果没有影响析结果没有影响，而对使用峰高，而对使用峰高定量的定量分析定量的定量分析结果有影响结果有影响。 v如其他因素不变，如：如其他因素不变，如：K， ，流速等，柱效增加流速等，柱效增加峰面积基本不变，而峰高峰面积基本不变，

36、而峰高增加增加6241.01.11.2231 液相色谱流动相的液相色谱流动相的组成变化，如采用梯组成变化，如采用梯度洗脱时，固定相、度洗脱时，固定相、洗脱液和待测组分之洗脱液和待测组分之间的平衡很难保持一间的平衡很难保持一致，洗脱时基线也常致，洗脱时基线也常出现漂移使峰面积、出现漂移使峰面积、峰高测量产生误差。峰高测量产生误差。样 品15l对二甲氧基苯色谱柱Resolve Silica溶 剂二氯甲烷/戊烷 从85:75到60:45k =3.0k =1.9k =4.9k =1.54 4、检测器特性、检测器特性 检测器工作的稳定性和线性范围直接影响色谱定量检测器工作的稳定性和线性范围直接影响色谱定

37、量分析结果的准确性和重复性。分析结果的准确性和重复性。5 5、分离度、分离度 分离度的大小直接影响峰面积和峰高的计算准确分离度的大小直接影响峰面积和峰高的计算准确度，进而影响色谱定量分析的准确度度，进而影响色谱定量分析的准确度。（四）定量分析的误差来源和校正方法（四）定量分析的误差来源和校正方法 色谱定量分析中的每一步操作过程都会带入误色谱定量分析中的每一步操作过程都会带入误差，最后定量分析结果的误差则是前面每一步误差差，最后定量分析结果的误差则是前面每一步误差的总合。的总合。1 1、系统误差、系统误差（1 1）样品制备过程中待测组分的损失）样品制备过程中待测组分的损失 溶解是否完全、浓缩和预

38、分离时是否有挥发、萃溶解是否完全、浓缩和预分离时是否有挥发、萃取和沉淀是否完全等取和沉淀是否完全等（2 2）色谱仪进样分流比、衰减比不正确或线性响应）色谱仪进样分流比、衰减比不正确或线性响应范围窄范围窄进样分流比不正确造成进样量误差；进样分流比不正确造成进样量误差；衰减比（记录仪）不正确造成峰面积测量误差；衰减比（记录仪）不正确造成峰面积测量误差；线性范围过窄，引起进样量不当，线性范围过窄，引起进样量不当，响应值超过线性范围，出现计算误差响应值超过线性范围，出现计算误差（3 3）由不正确的标准校正曲线）由不正确的标准校正曲线和校正因子引起和校正因子引起v曲线曲线A A：因在零浓度时仍有：因在零

39、浓度时仍有色谱峰，可能有杂质未分开色谱峰，可能有杂质未分开v曲线曲线B B：在此浓度内，检测：在此浓度内，检测器的响应值是非线性的器的响应值是非线性的v曲线曲线C C：可接受的理想状态：可接受的理想状态 v曲线曲线D D：表明有样品的损失：表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸，可能是色谱柱的非特征吸附，也附，也 可能是样品制备时的可能是样品制备时的损失损失 ABCD（4 4）测量者不良习惯和偏向引起）测量者不良习惯和偏向引起 由由(1)(1)、(2)(2)、(4)(4)产生的系统误差在色谱定量分产生的系统误差在色谱定量分析中可采用内标法或标准加入法加以校正，由（析中可采用内标法或标准加入法加以校正，由（3 3）产生的系统误差只能使用已知准确含量的标准）产生的系统误差只能使用已知准确含量的标准样品进行校正。样品进行校正。2 2、随机误差、随机误差 色谱定量分析中的随机误差是指那些原因无法查色谱定量分析中的随机误差是指那些原因无法查明、大小随机涨落而且不可避免的误差明、大小随机涨落而且不可避免的误差3. 3.过失误差过失误差主要是由操作者工作中的马虎和操作的错误引主要是由操作者工作中的马虎和操作的错误引起的。如：称量错误；样品处理时带入的组分损起的。如：称量错误；样品处理时带入的组分损失和污染；读数错误；仪器操作误差；计算错误失和污染；读数错误；仪器操作误差；计算错误等。等。