PCR操作步骤及结果ppt课件.ppt

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1、有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。PCR操作步骤有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。主要内容vPCR主要成分vPCR操作步骤vPCR注意事项vPCR操作常见问题讨论有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。PCR主要成分vBuffervMg2+vdNTPsvPrimervProbevT

2、aq DNA聚合酶v模板有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。BuffervPCR的反应buffer一般为10Xbufferv主要作用是提供反应的缓冲体系，维持反应的稳定，给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。v组成 Tris-HCl（pH8.3） 100 mM KCl 500 mM有利于引物与模板的退火v终浓度为1X有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。Mg2+vMgCl2（2

3、5mM）v作用Taq DNA聚合酶活性所必需的，提供离子浓度v通常Mg2+浓度范围为1-5mM。Mg2+可促进Taq酶活性影响反应产量，但浓度过高会增加非特异性扩增。对于一种未经实践的PCR反应，可以用0.5mM的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。v终浓度为2.5mM 有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。dNTPv4种脱氧三磷酸核苷酸（25mM）dNTP原液可稀释至25 mM并分装，-20贮存。v终浓度为0.3mM 有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激

4、励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。PrimervPCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定，一般PCR反应中的引物终浓度为0.1-0.5M。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。v终浓度为0.3M注意：稀释引物最好使用pH8.0TE，可以减弱引物的降解有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。Probev扩增产物片段中间的一段寡核苷酸片段。该探针的5端标记了一个荧光报告基团FAM（6-carboxyfluorescein

5、，6-羧基荧光素），3端标记了一条荧光淬灭基团TAMRA（6-carboxy-tetramethyl-damine，6-羧基四甲基若丹明）v终浓度为0.2M注意：稀释引物最好使用pH8.0TE，可以减弱引物的降解有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。Taq DNA聚合酶vTaq DNA聚合酶的酶活性单位定义为72下，30min，掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。v终浓度为1.5Uv注意：为保证酶的活性少受影响，应尽量保持-20

6、 环境有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。PCR反应步骤v反应体系配制v反应条件设定v上机运行，实时监测v结果判读vPCR产物验证有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。反应体系v小心在冰上加入下列溶液于PCR反应管中（30 l 反应体系）：v10buffer(Mg2+ free) 3 lvMgCl2（25mM） 3 lvdNTP（25mM） 0.36 lv上游引物（10 M） 1 lv下

7、游引物（10 M） 1 lv探针 （10 M） 0.6 lvTaq酶（5u/l） 0.3 lvddH2O 18.74 lvcDNA 2 l有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。加样顺序有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。扩增条件vStage1:94 2minvStage2:step1:94 20secstep2:55（可变）20secstep3:60 20secfor 45cyclesv

8、荧光检测设定在stage2-step3有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。复性温度vTM-25vTm=（G+C）4+（A+T）2有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。结果判读有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。产物检测v将反应产物取3-8l作2.0琼脂糖凝胶电泳，定性检测目的基因的扩

9、增水平有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。PCR注意事项v无菌操作v加样准确，快速（避免二聚体及非特异扩增的形成）v避免污染（如cDNA污染，气溶胶污染，唾液污染等）有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。常见问题v一、无 Ct 值（信号）出现： 1.反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号； 2.检测荧光信号的步骤有误：一

10、般采用 72延伸时采集荧光，Taqman 方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号； 3.引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性； 4.探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸； 5.模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起； 6.模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。v二、Ct值出现过晚： 1.反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等； 2

11、.PCR各种反应成分的降解或加样量不够 3.扩增产物片段过长：一般采用 100200bp 的扩增长度。有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。v三、溶解曲线不止一个主峰 1.引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现； 2.引物浓度不佳：适当调整引物浓度； 3.退火温度低：提高退火温度； 4.镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度； 5.模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA 的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为

12、导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。v四、重复性不好 1.加样不准确； 2.仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好； 3.模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。v五、扩增效率低： 1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解； 2.反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法； 3.反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。有利于学习和创新的组织管理机制，创造充满活力的创新激励机制，以市场为导向，以顾客价值追求为中心的企业文化氛围，依赖既开放又相互信任的合作环境。thanksthanks