DNA分子标记的研究进展及几种新型分子标记技术.doc

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1、黑龙江农业科学 2008( 1) : 102 104 Heilong jiang Ag r icultural Sciences 综述 D N A 分子标记的研究进展及几种新型分子标记技术 1 2 1 2 2 2 2 2 关 强, 张月学 , 徐香玲 , 孙德全 , 李绥艳 , 林红 , 潘丽艳 , 马延华 ( 1. 哈尔滨师范大学生命与环境科学学院 , 哈尔滨 150080; 2. 黑龙江省农业科学院草业研究所 , 哈尔滨 150086) 摘要 : 分子标记是继形态标 记 、 细胞 标记和 生化 标 记之 后 发展 起来 的一 种比 较理 想的 遗传 标记 技术 。 综 述了 DN A 分子

2、标记的类型 , 基本原理和特 点 , 同时还对几种最新出现的分子标记技术作了简要的 介绍 。 关键词 : 新型 DN A 分子标记 ; RG A s 标记 ; RM A P D; SRA P; T R AP 中图分类号 : Q 78 文献标识码 : A 文章编号 : 1002 2767( 2008) 01 0102 03 Development of DNA Molecular Marker and Several New Types of Molecular Markers 1 2 1 2 2 GUANQiang , ZHANG Yue xue , XU Xiang ling , SUN D

3、e quan , LI Sui yan , LIN Hong , PAN Li yan , MA Yan hua ( 1. Lif e and Environmental Co lleg e, H ar bin N orm al U niversit y, H ar bin 150080; 2. Pr at acult ural Science Inst it ut e, H eilongjiang A cademy of A g ricult ur al Sciences, H arbin 150086) Abstract: DN A molecular mar ker is a compa

4、r at ively ideal g enetic mar ker s develo ped after the shape ma rker, cellu lar ma rker and biochemical mar ker . In this paper , t he ty pes, basic pr inciples and char act ers wer e summar ized, meanw hile, several new ty pes of mo lecular mar kers wer e intro duced w hich appea red r ecently. K

5、ey words: DN A mo lecular marker; RGA s markers; RM A PD; SRA P; T RA P DN A 分子标记技术研究始于 19 世纪 80 年代 , 是指能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异 的特异性 DN A 片段 , 是 D N A 水平上遗传多态性的 直接反映 , 大多数 D N A 分子标记以电泳谱 带的形 式表现个体之间的 D N A 差异 , 是生物分类学、育 种学、遗传学和物种起源与进化等研究的重要技术 指标之一。 DN A 分子标记有以下优点 : ( 1) 具有较 强的多态性 ; ( 2) 直接以 DN A 为表现形式。

6、不受环 境、季节限制 , 不受个体发育阶段的影响 , 不存在基 因表达与否的问题 , 没有组织及器官特异性 ; ( 3) 许 多分子标记表现为共显性 ; ( 4) 数量的丰富性 ; ( 5) 表 现为 中性 ; ( 6) 经济方便和易于观察记录 。 根据北京农科院王军等 , 通过检测手段或相 关技术 , 将分子标记划分为三代四类 : 1 第一代分子标记技术 以 Sout hern 杂交为核心的分子标记技术。最 具代表性的是发现最早的 R FL P 标记。 RF LP ( Restr ict io n F ragm ent L engt h Po lymo rp 收稿日期 : 2007 05 2

7、9 第一作者简介 : 关强 ( 1982 ) , 男 , 黑 龙江人 , 在 读硕士 , 从事 遗传 学研究。 E mail: 120604766 163. com。 102 黑龙江农业科学 hism, 限制性片段长度 多态性 ) 是由 G rodzicker 等 于 1974 年创建 , 80 年代中期发展起来的一种最早 的分子标记。 RF L P 是由于 D N A 中限制性内切酶 酶切识别序列中出现碱基的变异而导致酶切位点的 增减所引起的限制性片段 长度的差异。基本原理 是 : 将 DN A 用已知的限制性内切酶消化后 , 产生大 小不等的 DN A 片段 , 电泳分离、 Sout he

8、rn 印迹转移 到硝酸纤维 膜上 , 用放 射性 标记探 针与 膜上 变性 DN A 杂交 , 放射自显影 , 显示出不同材料的多态性 图谱。 RF LP 标 记呈 共显性 遗传。该技 术步 骤繁 杂 , 工作量大 , 且 DN A 的需要量大 , 在很大程度上 限制了 R FL P 技 术的应用 。 2 第二代分子标记技术 第二代分子标记技术主要分为两类。第一类为 基于 PCR 的 DN A 分子标记。根据所 用引物的差 异 , 该类标记又分为随机引物 PCR 标记和特异引物 P CR 标记 , 随机引物 PCR 主要包括 RA P D 标记和 ISSR 标记等 , 特异引物 PCR 包括

9、SSR 标记和 ST S 标记等。第二类为基于 P CR 与限制性酶切技术结 合的 DN A 标记。这类标记包括两种 类型 , 一种是 通过限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段长度 2 2 2 1 2 1 1 期 关 强等 : DN A 分子标记的研究进展及几种新型分子标记技术 综述 的多态性 , 如 A F L P 标记等 , 另一种是通过对 PCR 扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段的多态性 , 2. 2. 1 标记 限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段 如 CA PS 标记等。 长度 的多 态 性 ( 1) A F L P ( A m plif ied F ragm ent 2. 1 基

10、于 P CR 的 DN A 分子标记 L eng t h Poly mor phism, 扩 增 片 段 长 度 多 态 性 ) : 2. 1. 1 随机引物 P CR 标记 ( 1) RA PD ( Random 1993 年由荷兰科学家 Zabeau 等创建的 A F LP 分子 Amplified Polymorphic DNA , DNA 随 机 扩 增 多 态 标记技术 , 是利用 P CR 技术检测 DN A 多态性的一 7 性 ): RAPD 是由 Williams 和 Welsh 两个研究小组于 1990 年分别研 究提 出的一 种分子 标记 , 是建 立在 种方法 。 A F

11、 L P 的基本原理是对 DN A 限制性酶 PCR 基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行 多态性 分析的 DN A 分子标记技术。以样品 DNA 为 模板 , 以一个人工合成的随机寡核苷酸序列为引物 , 通过 PCR 非定点扩增 DNA 片段 , 用凝胶电泳分析扩 增产物 DNA 片段的多态性 。 RA PD 具有技术简 单、检测迅速、灵敏度高、特异性强、检测容易、 DN A 样品用量少的特点 , 但 RA PD 为显性遗传 , 存在共迁 移问题 , 并且重复性较差。可将 RA PD 转化为 SCAR 标记 , SCA R 通常为 显性标 记 , 通过 转化 可以 增加 RA PD 标记

12、 的 稳定 性和 信息 量 。 ( 2) ISSR ( Inter simple Sequence Repeat s, 内部简单重复序列 ) : ISSR 分子标记是由 Ziet kiew iez E 于 1994 年创建的 , 是在 微卫星分子标记基础上发展起来的一种分子标记。 ISSR 基本原理与 SSR 相似 , 利用人工合成的 16 18 个核苷酸重复序列作为引物 , 对 SSR 之间的 DNA 序 列进行 PCR 扩增。 ISSR 在引物设计上比 SSR 简单 得多 , 不需知道 DN A 序列即可用引物进行扩增 , 又可 以比 RF LP、 RA PD、 SSR 提供更多的遗传信息

13、 , 现已 在遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化、系统发育 等研究方面被广泛应用。但 ISSR 作为一种显性标记 ( 部分共显性 ) , 多数情况下不能区别一个位点扩增的 DN A 片段 , 且不同物种 SSR 不同 , 造成引物在筛选上 具有相对的不随机性 。 2. 1. 2 特异引物 P CR 标记 ( 1) SSR ( Simple Se quence R epeat s, 简单重复序 列 ) : SSR 分子标记 由 Lit t M , 等于 1989 年创建 的。简 单重复序列 6 8 个核苷酸的重复序列 , 分布于整个基因组的不同位 置上。由于重复次数的不同及重复程度的不完全造

14、成了每个位点的多态性。根据其两端的保守序列设 计一对特异性引 物 , PCR 扩增 , 再经聚丙烯 酰胺凝 胶电泳即可显示不同基因型个体在这个 SSR 位点 的多态性 。 ( 2) ST S ( Sequence tag ged Sit e, 序列 标记位点 ) : ST S 标记是由 O lso nM 于 1989 年创建 的 , 是一种等位点的标记 , 在不同基因组间具有特异 性 , 它是将 RF L P 标记技术转化为基于 PCR 的方 法 , 通过设计一对长度约 20bp 的特异引物 , 对基因 组 DN A 进行扩增 , 该方法在设计引物时也需要测 序 , 但是 , 一旦获得引物 ,

15、 ST S 法就变得和 R A PD 一 样简单、迅速 。 2. 2 基于 PCR 与限 制性 酶切 技术 结合的 DN A 切片段进行选择性扩增。具体操作为基因组 D N A 经限制性内切酶双酶切后 , 形成分子量大小不等的 限制性片段 , 再将双链人工 接头 ( art ificial adapter) 连接在这些 DN A 片段的两端 , 形成一个带接头的 特异片段 , 并作为扩增反应的模板 , 扩增片段经过聚 丙烯酰胺凝胶电泳分离检测 。 2. 2. 2 对 PCR 扩增片段的限制性酶切来揭示扩增 区段的多态性 ( 1) CA P S( Cleaved A m plif ied Pol

16、y mor phic Sequence, 放大 剪切 序列 多 态性 ) : CA R S 标记是 1993 年由 P ar an 在 R A PD 技术的基础上发 展起来 的。 基本 流 程是 : 先 作 RA P D 分 析 , 回 收 RA PD 片段 , 克隆和测序 , 再根据 该序列设计特定 引物 , 进行 PCR 扩增 , 可以鉴定出与原来的 RA PD 片段相对应的单一位点。该标记为共显性遗传。由 于 CA R S 标记使用的引物长 , 因而实验的可重复性 高 , 因此比 RA P D 和其它利用随机引物的方法在基 因定位和作图中的应用要好 。 3 基于单核苷 酸多态 性的 DN

17、 A 分 子 标记 第三 代分 子 标记 是 基于 单 核苷 酸 多 态性 的 DN A 分子 标记 , 如 SN P s 标 记。 ( Simple N ucleo t ide P olym orphisms, 单核甘酸多态性 ) 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或 几个核苷酸的差异 , 从分子水平上对单个核苷酸的 差异进行检测具有重要意义。随着计算机和 D N A 芯片技术引入分子生物学领域 , 研究者可同时对成 千上万个克隆测序 , 用计算机分析数据和显示最终 结果。目前 , 检测 SN P s 标记最常用的方法有两种 , ! 随机扩增 DN A ( RA PD ) 法 , DN

18、A 芯片 ( DN A chip) 检测法 。 4 几种新型分子标记 4. 1 RG A s 标记 ( R esist ance G ene A nalogs, 抗病 基因类似物 ) R GA s 是用基于抗病基因保守序列设计的引物 扩增基因组得到的抗病基因类似序列的新型的分子 标记。尽 管 基 因间 整 个 序列 的 同源 性 不 足于 用 RF L P 杂交检测 , 但抗病基因中存在的这些保守区 域为在其它植物中进行 PCR 扩增和分离 RG A s 提 供了机会 。 4. 2 R MA P D 标记 ( random micr osat ellit e amp lify 黑龙江农业科学

19、103 3 4 5 6 1 综述 黑 龙 江 农 业 科 学 1 期 po lymo rphic DN A , 随机微卫星扩增多态 ) 利用 R A PD 引物和微卫星上游或下游 引物结 合 , 对基因组 DN A 进行扩增 , 探索更有效的揭示所 有微卫星及其他 DN A 遗传多态性的方法 , 以期获 得研究 DN A 多态性的新的分子标记方法。因该方 法同时利用随机引物和微卫星引物进行扩增 , 暂时 定名为随机微卫星扩增多态 DN A 。 4. 3 SRA P( Sequence Relat ed A m plif ied P olym or phism, 相关序列扩增多态性 ) SR A

20、 P 标记是基于 P CR 技术的新型分 子标记 技术 , 其 原理是利用基因外显子里 G 、 C 含量丰富 , 而启动子和内含子里 A 、 T 含量丰富的特点设计两 套引物 , 对开放阅读框架进行扩增。此技术具有简 便、稳定、中等 产率和容易得到 选择条带序列 的特 点 , 在基因组中分布均匀 , 适合于不同作物的基因定 位、基因克隆和遗传图谱构建 。 4. 4 T RA P 标记 ( T arget Region A m plif ied Po ly m orphism, 靶位区域扩增多态性 ) T RA P 是由 H U JG 等于 2003 年从 SRA P 技术 改 进而来的新型分子

21、标记技术 , 其原理是借助大规 模测序技术产生的庞大生物序列信息 , 利用生物信 息学工具和表达序列标签数据库信息设计引物 , 对 目标候选基因序列区进行 P CR 扩增产生多态性标 记。此标记具有操作简单、重复性好、稳定性好、效 率高的特点。目前已经成功应用于许多植物的遗传 图谱构建、重要性状基因标记、种质资源的多样性研 究及分子标记辅助育种等方面 。 分子标记作为新的遗传标记 , 具有比形态标记、 细胞标记和同工酶标记显著的优点 , 因此自分子标 记诞生短短 20 多年间 , 已发展了许多种分 子标记技 术 , 并已被广泛应用于动植物遗传育种、连锁图谱构 建、基因定位与克隆和物种鉴定等方面

22、。尽管分子 标记有许多优势 , 但目前发现的任何一种分子标记 均不能满足作为理想的遗传标记的所有要求 , 但可 以预见 , 在不久的将来 , 分子标记技术会产生深远的 影响。 参考文献 : 1 王军 , 谢皓 , 郭二虎 , 等 . DNA 分子标记及其在谷子遗传育种 中 的应用 J . 北京农学院学报 , 2005, 20( 1) : 76 80. 2 王晓梅 , 杨秀荣 . DNA 分子标 记研究 进展 J . 天 津农 学院 学 报 , 2000, 7( 1) : 21 24. 3 邓俭英 , 刘忠 , 康德贤 , 等 . RAPD 分子标 记技术在 蔬菜研究 中 的应用 J . 种子

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