动物细胞培养技术研究进展.doc

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1、2007 年 8 月 重庆文理学院学报 (自然科学版 ) Aug , 2007 第 26 卷 第 4 期 Jou rnal of Chongq ing Un iversity ofA rts and S cien ces (N atu ral Science Ed ition) Vol 26 No 4 ( 1. 西南大学 动物细胞培养技术研究进展 孔 永 , 秦秀云 生命科学学院 , 重庆 北碚 400715; 2. 山东省东营市第一中学 , 山东 东营 257091) 摘 要 动物细胞培养是生物 、 医 学研究和应用中广泛采用的技术方法 , 可分为原代和传代 培养 , 有贴壁 、 悬浮和固定

2、化培养等培养方式 . 细胞生长具有特殊的生物学性质 , 需要无菌 、 恒 温和充分的营养环境 . 动物细胞培养技术在拥有广阔的发展空间和光明前景的同时也面临着 诸多问题和挑战 . 关键词 细胞培养 ; 微载体 ; 中空纤维 ; 微囊 ; 生物反应器 中图分类号 Q 813. 1 文献标识码 A 文章编号 1673- 8012( 2007) 04- 0054- 03 1885 年 , W Roux 尝试使组织 离体培 养 , 被 认为是 组 织细胞培养技术的萌 芽 ; 1907 年 H a rr ison 和 1912 年 C ar re l 开始把组织培养作为一种方法 , 用于研究 离体动物

3、细 胞的培养 , 标志着细胞培养 技术 ( Ce ll culture techno logy) 的诞生 . 此后 , 随着抗生素、培养基、培养 装置以及工艺方 法的不断改 进 , 动 物细 胞培 养 ( A ni a l ce ll cu lture) 的 研 究和应用逐步增多和 深入 , 发展至今已成为在生物、医学 研究 和应用中 广泛采用的 技术方法 . 利用细 胞培养开 展 体外试验 , 成为了阐释生命现象、发病机理和筛选药物的 重要手 段 ; 利 用 细 胞 培 养 技 术 结 合 细 胞 融 合 ( C ell fu sion)、细胞 杂 交 ( Cell hybr id izat

4、ion) 以 及转 基 因 ( T rans gene) 技术进行基因重组、组织构 建是遗传和 组织工程 的 重要工具 ; 利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生 长因子、疫苗和单抗等 , 已成为 医药生物技术产业的重要 部分 . 1 基本概念 细胞培养是指从 体内组织取出细胞模拟体内生存环 境 , 在无菌、适当温度 及酸碱 度和一 定营养 条件下 , 使 其 生长 繁殖并维 持结构和功 能的一种培 养技术 . 从体内 取 出细胞首次培养即为原代培养 ( P r i ary Cu lture), 这是 细 胞培 养的最初 和必经阶段 . 当原 代培养细胞 生长到一 定 时期 , 受到群体环境

5、限制 , 就需 要转移到另一容器才能继 续生长 , 称为传 代或 继代培 养 ( Subculture ). 根据 原代 培 物性状 的 一 致 性 与 否 , 传 代 成 功 后 称 为 细 胞 系 ( Ce ll line)或细胞株 ( Cell Stra in). 这 些细 胞一 般可 顺 利传 40 50 代次 , 并保持 染色体 二倍 体数 量和 接触 抑制 , 传 至 50 代左右时则出 现生 长停 滞 , 大部分 衰老 死亡 , 此类 称 * 收稿日期 2007- 04 - 09 基金项目 国家 十五 重点科技攻关项目 ( 2004A717B - 03) 为有限细胞系 /株 ;

6、在细胞传 代的过 程中 , 有些 因发生 遗 传突变获得 了持久性 增殖能力的 细胞称为无 限细胞系 / 株 . 2 体外培养动物细胞的生物学特性 动物细胞无细 胞壁 , 机 械强 度低 , 对 剪 切力 敏感 , 适应环境能力差 ; 倍 增时 间长 , 生 长缓 慢 , 易受 微生 物 污染 ; 对生长环境和培养环境要求苛刻 . 2. 1 细胞生命周期性变化 体外培养的细胞从适应 环境、旺盛 生长到 由于自 身 和环境限制缓慢或停滞生长经历一个周期变化 . 1. 潜伏期 ( L atent phase) 细胞从接种到适应新环 境生长 繁殖的 一段 时间 , 此 间细胞胞质回缩 , 代谢缓慢

7、. 2. 指数生 长期 ( L ogarthm ic grow th phase) 指数生长期是细胞活力最好的时期 , 细胞增 殖旺盛 . 在接种细胞数量适宜的情况下 , 指 数生长期 持续 3 5 d 后 , 随细胞数量不断 增多 , 生长空 间日趋减 少 , 营养环 境 恶化 , 呈现接触抑制 ( Contact inh ib ition ). 恶性 细胞则 由 于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑 制 ( D ensity inh ibition). 3. 稳定期 ( Stagnate phase) 细胞数量达到饱和密度 后 , 细胞与 营养液 的交换 面 积减少 , 代谢产

8、物积 累 , pH 值下 降 , 细 胞停 止增 殖 , 进 入 停滞期 . 营养环境继续恶化后 , 细胞受损直至死亡 . 2. 2 体内外细胞的差异 细胞在体外培养后 , 失去了 神经体 液调节 和细胞 间 相互影响 , 生活在缺乏动态平衡的环境中 , 失去原有组织 54 作者简介 孔永 ( 1983 - ), 男 , 山东滕州人 , 硕士研究生 , 主要从事组织工程皮肤研究 . E - m ai: tzkongyong 163. com 1 2 1 1- 2 结构和细胞形态 , 分化特性减弱或不明显 , 直至发展成恶 性细胞 . 离纯化等特点 . 4. 3. 1 微载体培养 (M icro

9、- ca rr ier cu lture) 3 细胞培养环境和生长条件 传统的贴壁依赖性细胞的培养通过静止或转瓶等培 3. 1 无菌无毒环境 养来获得 , 操作 繁复 , 且耗 费空 间 及人 力 . 1967 年 , 3 V an 无菌无毒的操作 环境和培养环境是保证细胞在体外 W ezel 首次提出了 微载体 培 养系统 , 使贴壁依 赖型 培养成功的首要条件 . 在体外培养的细胞 , 由于缺乏对微 生物 和有毒物 的防御能力 , 一旦 被微生物或 有毒物质 污 染 , 或者自身代 谢物 质积 累 , 就可 能会 导 致细 胞中 毒 死 亡 . 因此 , 在体外培养细胞时 , 应及时清除细

10、胞代谢产物 , 以保持细胞生存环境 无菌无毒 . 3. 2 恒温 要维持培养的细 胞旺盛 生长 , 必须有 恒定适 宜的 温 度 . 偏离适当的温度范 围 , 细 胞会受 到损伤 , 影响 正常 代 谢甚至死亡 . 3. 3 气体环境 气体是哺乳动物 细胞培 养所必 需的条件 之一 , 所 需 气体 主要有氧 气和二氧化 碳 . 氧 气参与三羧 酸循环供 给 细胞能量和生长组分 ; 二氧化碳既是细胞代谢产物 , 也是 细胞增殖所需成分 , 并对调节培养基 pH 值有 重要作用 . 3. 4 缓冲环境 该环境的作用是 维持细胞渗透压 , 提供缓冲系统 , 使 培养 液的酸碱 度维持在培 养细胞生

11、理 范围内 , 提供细 胞 正常代谢所需的水分 和无机离子等 . 3. 5 培养基 培养基既是细胞 培养中供给细胞营养和促进增殖的 基础物质 , 也是细胞生长繁殖的直接环境 . 培养基分为天 然培 养基和合 成培养基 . 天然培 养基从动物 体液或组 织 中分离提取 , 如血浆、血清、淋巴 液、鸡 胚浸出 液等 ; 合 成 培养基是根据天然培 养基的成分 , 模拟合成、配制的培养 基 . 它包含细胞生长的无机盐、氨基酸、维生素、糖类等基 本物 质和一些 特殊的添加 成分结合适 量添加血 清 , 广 泛 应用于动物细胞培养 . 4 细胞的培养方式 4. 1 贴壁培养 (M ono laye r

12、culture) 贴壁培养主要适 用于贴 壁依赖 性细胞 . 一般 源于 实 体组 织的细胞 需要相互依 赖 , 需 贴附于不起 化学作用 的 物质 ( 玻璃或塑料等无活性物质 )的表面 生长、生存和 维 持 , 并最终在附着面生长至单层 , 铺满平面时便会发生接 触抑制 . 4. 2 悬浮培养 ( Suspension culture) 悬浮适应细胞、源于循 环系统 的细胞 及肿瘤 细胞 等 非贴 壁依赖性 细胞无需支 撑面 , 细胞或细胞 聚集体悬 浮 于液 体培养基 中增殖 . 悬浮培养 是大规模细 胞培养的 理 想方式 . 4. 3 固定化培养 ( Imm ob iliz ing cu

13、 lture) 固定化培养是一 种包埋 培养方 式 , 适 用于贴 壁依 赖 性细胞和非贴壁依赖 性细胞 . 它具有剪切力低、传递效果 好和抗污染能力强、细胞生长密度高、产物易于收集和分 细胞贴附在 微载体上悬 浮于液体 培养基中生 长 , 兼 具平 板培养和悬 浮培养的优 势 , 增 加培养面 积同时获得 均一 的环境 培养 条 件 ( 温度、 pH 值、 CO2 浓度、葡 萄糖 浓 度 等 ), 便于控制 放大 获得 高密 度培 养细 胞和 优化 下游 控 制 . 4. 3. 2 中空纤维培养 (H o llow fibres culture) 1972 年 , R ichard K na

14、zek 首次报道该技术 . 该 技术 是模拟 细胞 在体 内生 长的 三维 状态 , 利用 一种 人工 的 毛细管 即中 空纤 维给培 养的 细胞 提供物 质代 谢条 件 而建立的一 种体外培养 系统 . 中空纤维 表面具有海 绵状 多孔结构 , 既能使水 分子、营养物 质和气体 透过 , 也能 使 细胞在上面贴附生长 . 该技术的特点是 : 细胞培养环境温 和 , 培养细胞密度较高 , 产品较容易分离纯化 . 4. 3. 3 微囊法培养 (M icro- encapsulation culture) 微囊化培养技术是 20 世纪 70 年 代由 L in 和 Sun 创 建的一种大规模培养技

15、 术 . 其要点 是 : 在无 菌条件 下 将拟培养的 细胞、生物活性物 质及生长 介质共同包 裹在 薄的 半透膜中形成微囊 , 再将微囊放入 培养系统内 进行 培养 . 培 养液中的 水和营养物 质可透过 半透膜进入 微囊 供应给细胞 , 细胞的代谢物也可透过半透膜被排 出 , 而细 胞分泌的大 分子物质则 被阻留而 积累在囊内 . 微囊 化培 养有诸多优点 : 首先 , 细胞能生长和维持在小体积的培养 液中 , 这使培养液中 的分泌产 物变浓 , 简化 了下 游加工 ; 其次 , 培养液易于迅速改变 , 且无分离细胞与培养液的困 难 ; 最后 , 微囊固定化细胞还能使细胞较少暴露于物理损

16、伤环境中 . 用微胶囊培养可保护细胞在胶囊内 , 可起到中 空纤维的某 些作用 , 也可避免 反应器 的 剪切力对细 胞的 损伤 . 5 存在问题与展望 体外动物细胞培养中铵离子、乳 酸和 CO2 的积 累对 细胞产生毒 性作用或者 改变细胞 代谢水平 , 抑制细 胞生 长 , 需要及时改 善培 养环 境 . 细胞 凋亡 是大 规 模细 胞 培养过程的重要制约环节 , 用基因工程方法将 bc l - 2 基 因这种细胞 凋亡抑制基 因导入细 胞 , 成 为众多研究 者的 选择 . Bc l- 2 基因的过量 表达能 抑制 G ln 或氧 缺乏 引起的细胞凋亡 , 减少细胞特定营养成分的消耗 ,

17、 提高细 胞密 度 和目的蛋白产量 . 培 养基中 所添加 的血清 主要 来源于动物或人 , 但存在潜在的污染源、不同批间蛋白含 量差异大及 价格高等缺 点 . 有 些细胞株 依赖于血清 源性 生长因子的 特性可通过 分子遗传 途径予以改 变 , 即 导入 特异生长因 子的基因 , 使细胞 能合成自 身的生长因 子来 满足 细胞生长需要 , 而对 细胞生 长无副 作用 . 另外 , 导 入一些基因改变细胞生长周期的调控也可使细胞在无血 55 1- 2 清 / 蛋白的培养基中生 长 9 . 只 要在 培养 基中增 加某 些 2 翟中和 , 王喜忠 , 丁明孝 , 等 . 细胞生 物学 M . 北

18、京 : 适于细胞生长的成 分 , 如纤连 蛋白、转铁蛋 白、胰 岛素 和 表皮 生长因子 等 , 不 少细胞即能 在无血清供 应的情况 下 生长 . 通过细胞工程方法使细胞高水平表 达外源基 因 并正确加工表达 产物 , 从而提高整个表达系统的产率 , 也 成为应用大规模动物 细胞培养生产外源目的蛋白的研究 的重 要手段 . 改善细 胞环境是当 前众多生物 反应器及 控 制器 研究者的 不懈努力方 向 . 随 着对细胞生 长和产物 生 成之 间相关性 研究的深入 , 对生 物反应器更 多培养状 态 参数的在线检测以及 各种新细胞生物反应器系统的开发 利用 , 新的培养 / 控制模式将 会在现有

19、基础上不断产生 . 经过几十年来的 研究与 实践应 用 , 动 物细胞 培养 技 术已日趋完善 , 发展方向将集中在改进细胞特性 , 优化细 胞环 境 , 扩 大生产规 模和提高目 的产物的产 率与产量 等 几方面 . 1)开发能高密度生长、能分 泌大量 目标产 品的细 胞 系 ; 2)研制细胞 生长 性能 优良、吸附 细胞 容易、解 离 细 胞容易并能重复使用 的新型微载体 ; 3)研制规模 化生 物反 应器 , 实时 检测 系统 , 剪 切 力 小、混台性 能好的新 型细胞培养 系统和细胞 培养与产 物 分离的耦合系统 ; 4)设计新的适合于各个体细胞株 (系 )的无 血清、无 蛋白培养基

20、 , 使生物制品更安全 ; 5)开展三维细胞培养及组织工程研究 . 参考 文献 1王捷 , 等 . 动物细胞培 养技术与 应用 M . 北京 : 化 学 工业出版社 , 2004: 1- 9. 高等教育出版社 , 2000: 66- 67. 3 石凯 , 熊晓 辉 , 许建生 . 固 定化 动物 细胞 大规 模培 养 技术研 究 进展 J. 化 工 进 展 , 2002, 21 ( 8 ): 556 - 559. 4 M arya I C, Julio A L, R icardo J G. So lv ing design equa tions for a ho llow fiber b io

21、reactor w ith arb itra ry k inetics J. Chem ical Eng inee ring Journal, 2001( 84) : 445- 461. 5 林福玉 , 陈昭烈 , 刘红 , 等 . 大规模 动物细 胞培养 的问 题及对策 J. 生物技术 通报 , 1999 , 10( 1): 32- 35. 6 Suzuki E, T erada S, U eda H, et a . Estab lish ing apopto sis resistant ce ll lines for i prov ing pro te in productiv ity o

22、f ce ll line J. Cy totech, 1997( 23 ): 55- 59. 7 T erada S, Itoh Y, U eda H, e t a.l Character ization and fed- batch cu ltu re o f hybr idom a overexpressing apopto sis suppressing gene bcl- 2 J . Cy totech, 1997( 24): 135- 141. 8 P ack SCO, H unt SM N, B ridgesM J, et a . Supe r- CHO - a cell line

23、 capable o f autocr ine grow th under fu lly de fined pro tein - free conditions J. Cy to techno logy, 1996( 22 ) : 139- 146. 9 R enner W A, L ee KH, H atzi anikatis V, et a.l R e comb inan t cyclin E in express ion activa tes pro liferation and surface attachm ent o f Chinese ham ster ovary ( CHO )

24、 cells in prote in - free med ium J . B io tech B ioeng, 1995, 47: 476- 482. 10 S inacore M S , D rapeau D , A dam son S R. A daptation o fm amm alian cells to grow th in serum free m ed ia J. M o l B io techno , 2000, 15 ( 3): 249. T he P rogress of An i a l C ell Culture T echno logy 1 2 KONGY ong

25、 , Q IN X iu- yun ( 1. S choo lo f L ife S cien ce, S o uthw e s t Un ive rs ity, B e i e iC ho ngq ing 400715, C h ina; 2. No. 1 M idd le S cho o lo fDon g Y ing in S han Dong P rov ince, Don gy i g S ha ndong 257091, C h i a ) Abstract: A n i al cell cu lture including pri ary culture and subcultu

26、re is a techno logy w ide ly used in the re search and applica tion of bio logy and m ed ica l sc ience, a lso there are m ono layer culture suspension culture, i m obilizing culture three modes. T he grow th and m u ltiplication of cell needs sterilion, hom oeo therm ic and su ff icient nutrition. A n i al cell culture techno logy is now facing cha llenge and opportunity, and it is be ing m ore and m o re i portant in sc ience and soc ie ty. K ey w ord s: ce ll cu lture; m icro- carrier; hollow f ibres; m icro- encapsulat ion; b ioreactor 56 10