实时荧光定量PCR技术综述.doc

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1、 技术与方法 生物技术通报 实时荧光定量 技术综述 邓文星 张映 （ 山西 农业大 学动物 科技学 院 ， 太谷 ） 年第 期 摘 要 ： 实 时荧光定 量 技 术是在 技术 基础上 发展起来 的一种 高度灵 敏的 核 酸定量技 术。与传 统 相 比 ， 实时 定量 能够更 加快速 、灵 敏 ， 并有 效地对 核酸进 行定量检 测。 关键 词 ： 实 时荧光 定量 标准曲 线 （ ， ， ） ， ： ， ， ， ： 聚 合 酶 链 反 应 （ ， ） 技 术是 年 开 始出 现 的 一项 基 因 检 测 技 术 。由 于 技 术 简便 易 行 、灵 敏 度高 等 优 点 ， 该 技术 被 广

2、泛应 用 于基 础 研究 ， 成 为分 子 生 物学 必 不 可 少的 研 究工 具 。由于 传 统 的 技 术 存在 ， 不能 准 确定 量 ， 且 操 作 过 程 中易 污 染 而 使 得 假 阳 性 率 高 等 缺 点 ， 使 其应 用 受 到局 限 。对 产物 进 行准 确 定量 成 为 技 术 发展 的 重要 方 向 。 定 量 （ ， ） 先后出现了 多种方法 ， 目前为 止 ， 其 中 结 果 最 为 可 靠 的 就 是 实 时 荧 光 定 量 （ ， ） 。 年 ， 实时 荧光定量 技 术由美 国 公司 首 先推 出 。这 项 技术 是 指在 反 应 体系 中 加入 荧 光染

3、料 或 荧光 基 团 ， 利 用 荧 光 信号 来 实 时监 测 整 个 进 程 ， 最 后 通过 标 准 曲 线 对 未 知模 板 浓度 进 行定 量 分析 。其 特点 有 ： （ ） 用 产生 荧 光信 号 的指 示 剂显 示 扩 增产 物 的 量 ， 进 行 实 时动 态 连 续 的 荧 光 监 测 ， 避免 终 点 定 量 的 不 准 确 ， 并 且 消 除了 标 本和 产 物的 污 染 ， 且 无 复 杂的 产 物 后 续处 理 过 程。 （ ） 荧光 信号 通 过荧 光染 料 嵌入 双链 ， 或 荧 光探 针 特异 结 合 目 的检 测 物 等方 法 获 得 ， 大 大 提 高 了

4、检 测的 灵敏 度 、特 异性 和 精确 性 。 可 以应 用 于 表 达 的 研 究 、 拷 贝 数 的 检 测 、单 核 苷 酸 多 态 性 的 测 定 、细 胞 因 子 的 表 达 分析 、肿瘤 耐 药 基因 表 达 的研 究 以 及 病毒 感 染 的 定 量监 测 。 实时 荧光 定 量 技 术 的 基 本 原 理 在 反 应 体 系 中 加 入 荧 光 染 料 或 荧 光 基 团 ， 这些 荧 光物 质 有 其特 定 的 波 长。 仪 器 可以 自 动 检 出 ， 利 用 荧光 信 号 积 累 ， 实 时 监 测 整 个 进 程 ， 在 循 环 中 ， 测 量 的 信 号 将 作 为

5、荧 光 阈 值 的 坐 标 。并 且 引入 一 个 值 （ ） 概 念 ， 值是 指 产生 可 被检 测 到的 荧 光 信号 所 需的 最 小 循 环 数 ， 是在 循环 过 程 中 荧 光 信 号 由 本 底 开 始 进入 指 数增 长 阶 段 的拐 点 所 对应 的 循 环 次数 。 荧 光 阈 值 相 当 于 基 线 荧 光 信 号 的 平 均 信 号 标 准 偏 差 的 倍。 一 般 认为 在 荧 光 阈值 以 上 所测 出 的 荧 光 信 号是 一 个可 信 的 信 号 ， 可 以 用于 定 义 一个 样 本 的 值。通 常 用不 同 浓度 的 标准 样 品的 值来 产 收稿日期 ：

6、 作者简介 ： 邓文星 ， 山西农业大学 ， 生物 技术 通报 年第 期 生 标准 曲 线 ， 然后 计 算 相 对方 程 式 。方 程 式 的斜 度 灭 基 团 （ 发 生 荧 光共 振 能 量 转 移 ， ） ， 检 测 不 到 可 以 用来 检 查 的 效 率 ， 所 有 标准 曲 线 的 线 性 该 探针 端荧 光基团 发出 的荧光 。在 扩增中 ， 回 归 分析 需 要 存 在 一 个 高相 关 系 数 （ ） ， 这 溶 液 中的 模 板变 性 后 低温 退 火 时 ， 引 物 与探 针 同 时 样 才能 认 为实 验 的过 程 和 数据 是 可 信 的 ， 使 用这 个 方 程

7、式 计算 出 未 知 样 本 的 初 始 模 板 量 。 实 时 荧 光 定 量 仪 都 有软 件 ， 可 以 从 标准 曲 线 中 自 动 地 计算 出 未知 样 本的 初 始模 板 量。 实 时 荧 光 定 量 技 术 中 荧 光 标 记 方 法 的 分 类 目 前 所 使 用 的 荧 光 化 学 方 法 主 要有 四 种 ， 分 别 是 结 合染 料 法 ， 水解 探 针 法 ， 杂 交探 针 法 ， 荧 光引 物 法。它们 又 可 分为 扩 增序 列 非特 异 和扩 增 序列 特 异两 类 检测 。 扩 增序 列 非 特异 性 检 测 方 法 的基 础 是 结 合 的荧 光 分子 ，

8、如 。 发 展 早 期就 是 运 用 这 种 最 简单 的 方 法 ， 在 反 应 体 系中 ， 加入 过 量 荧 光 染 料 ， 荧光 染 料 特异 性 地 掺 入 双 链 后 ， 发 射 荧 光 信 号 。 荧 光 染 料 的 优 势 在 于 它 能 监 测 任 何 序 列 的扩 增 ， 不 需 要 探 针 的 设 计 ， 使 检 测 方 法 变得 简 便 ， 同 时也 降 低 了检 测 的 成本 。 然 而正 是 由 于 荧光 染 料 能 和 任 何 结 合 ， 因 此 它 也 能 与 非特 异 的 （ 如 引 物二 聚 体 ） 结合 ， 使 实验 容 易 产生 假 阳性 信 号。引 物

9、二 聚 体的 问 题 目前 可 以用 带 有 熔 解 曲 线 （ ） 分 析 的 软 件 加 以 解 决 。由于 对 有 一定 的 抑制 性 ， 并 且 荧光 强 度较 低 ， 稳 定 性差 。近 来 试剂 公 司针 对 存 在 的 缺 点 开 发 了 一 些 性 能 改 进 的 染 料 ， 如 、 、 、 等 。 扩 增 序列 特 异 性 检 测 方 法 是 在 反 应 中 利 用 标记 荧 光基 因 的特 异 寡 核苷 酸 探 针来 检 测 产 物 ， 包 括水 解 探针 法 ， 杂 交 探针 法 ， 荧 光 引物 法 。 水 解 探 针 法 目 前 在 中 最 广 泛 使 用 的 系 统

10、 就 是 运 用了 这 个 原 理 。 扩 增 时 在 加 入一 对 引物 的 同时 加 入 一个 特 异 性的 荧 光 探 针 ， 该 探针 为 一寡 核 苷酸 ， 两端 分 别 标 记一 个 报 告荧 光 基 团和 一 个 淬 灭荧 光 基 团 ， 探 针 完 整 时 ， 端 荧 光 基 团 吸收 能 量 后 将 能 量 转 移 给 临 近 的 端 荧 光 淬 ， ， 与 模 板结 合 。在 引 物 的介 导 下 ， 沿 模 板 向前 延 伸 至 探 针 结合 处 ， 发 生 链的 置 换 ， 酶 的 外 切 酶 活 性 （ 此 活 性 是 双 链 特 异 性 的 ， 游 离 的 单 链

11、探 针 不 受 影 响 ） 将 探 针 端 连 接 的 荧 光 基 团 从 探 针 上 切 割 下 来 ， 游 离于 反 应 体 系 中 ， 从 而 脱 离 端 荧 光 淬 灭 基 团 的 屏 蔽 ， 接 受 光 刺 激 发 出 荧 光 信 号 ， 即 每 扩 增 一 条 链 ， 就 有 一个 荧 光 分子 形 成 ， 实 现 了 荧 光 信 号 的 累 积 与 产 物 形成 完 全 同 步 。 直 接 的 方 法 指 的 是 标 记 荧 光 的 探 针 与 扩 增 产 物 结 合 后 即 直 接 产生 荧 光。 针 对 探 针 荧 光 淬 灭不 彻 底 的 问 题 ， 年 美 国 公 司 推

12、 出 了 一 种 新 探 针 探针 。 探 针 端 采 用 了 非 荧 光 性 的 淬 灭 基 因 ， 吸 收 报 告 基 团 的 能 量 后 并 不 发 光 ， 大 大 降 低 了 本 底 信号 的 干 扰。此 外 ， 探 针的 端 还连 接 了 一 个 二 氢环 化 吲 哚 卟 啉 三 肽 ， 可以 大 大 稳 定 探 针 与 模 板 的 杂 交 ， 升 高 探 针 值 ， 使 较 短 的 探 针 同 样 能 达 到 较 高 的 值 并 且 短 探 针 的 荧 光 报 告 基 团 和 淬 灭 基 团 的 距 离 更 近 ， 淬 灭 效 果 更 好 ， 荧 光 背 景 更 低 ， 使 得信

13、噪 比更 高 。 法 ， 一 种 ， 构成 的杂 合 探 针 ， 与 组 合 使 用 ， 内 部 含 有 碱 基 ， 端 标 记荧 光 物 质 ， 端 标 记 淬 灭 物质 。 探 针 完 整 时 ， 荧光 淬 灭作 用 抑制 荧 光 物 质发 出 荧 光。 当 探 针 与 扩 增 产 物中 的 互 补 序 列 杂交 ， 切 断 探 针 的 部 分 ， 淬 灭作 用 解除 ， 荧光 物 质发 出 荧光 。 杂 交 探 针法 罗 氏专 利 的 探 针 又 称 为 双杂 交 探 针 ， 或 者 探针 。 探 针 由两 条 和 模 版 互 补 、且 相 邻 的 特 异 探 针 组 成 （ 距 离 ）

14、 ， 上 游 探 针 的 端 标 记 供 体 荧 光基 团 ， 相 邻 下 游探 针的 端 标 记 受体 荧 光 基 团 。 当 复性 时 ， 两 探 针 同 时 结 合在 模 板 上 ， 供 体 基 团和 受 体 基 团 紧 密 相 邻 （ 距 离 ） ， 激 发 供 体产 生 的 荧 光 能 量 被 基 团 吸 收 ， 使 得 检 测 探 头 可 以 检 测 到 发 出波 长 为 的 荧光 。当 变性 时 ， 两 探 针 游 离 ， 两 基 团距 离 远 ， 不 能 检 测到 波 长的 荧 光 。 年第 期 邓文星等 ： 实时荧光定量 技术综述 检 测的 信 号是 退 火时 的 实 时信

15、号 ， 每次 检 测 信 号始 了 标 准 化加 入 反 应 体 系的 或 的 量 ， 往 往 终 严 格 对 应 模 版 的 数 量 ， 非 累积 信 号 ， 可 以 用 于 做 曲线 和 检 测。 分 子 信 标 （ ） 是 一 种 呈 发 夹 结 构的 茎 环双 标 记寡 核 苷 酸探 针 ， 两端 的 核 酸 序列 互 补配 对 ， 因 此 标记 在 一端 的 荧 光 基团 与 标 记在 另 一 端的 淬 灭基 团 紧紧 靠 近。荧 光 基团 被 激发 后 产生 的 光子 被 淬灭 剂 淬灭 ， 由 荧光 基 团 产生 的 能 量 以红 外光 而不是 可见光 形式 释放出 来 。在 复

16、性温 度下 ， 因 为模 板 不存 在 时形 成 茎 环结 构 。当 加 热变 性 会互 补 配对 的 茎环 双 链解 开 ， 如果 有 模 板存 在 环 序 列将 与 模板 配 对。 与 模板 配 对 后 ， 分 子 信 标将 成 链 状而 非 发夹 状 ， 使 得 荧光 基 团 与淬 灭 剂 分开 。 当 荧光 基 团 被激 发 时 ， 淬 灭作 用 被解 除 ， 发 出 激发 光 子。 荧 光 引 物 法 荧 光 引 物 法 从 分 子 信 标 的 概 念 变 化 而 产 生 的 一 种联 合 分子 探 针 系统 ， 它把 荧 光 基团 标 记 的 发夹 结 构 的 序 列直 接 与 引

17、 物 相 结 合 ， 从而 使 荧 光 日 出引 物 （ ） 、蝎 子 引物 （ ） 、 引 物 、 引 物 、 （ ） 引 物。 实 时 荧 光 定 量 技 术 的 实 验 方 法 以 为 起 始 实 验 材 料 。 分 为 两 种 ： （ ） 法 ， 反转 录 反应 和 反应 在 同一 反 应 管 中进 行 。操 作 简单 、反 应 连 续、污染 几 率 低 ， 适 合 于 病原 体 的检 测 。 （ ） 法 ， 反 转 录 反应 和 反应 分 两 步 进 行 ， 反 转 录 反 应 液 （ ） 作 为 反 应 的 模板 ， 适合 于 表 达量 的 解析 。 以 为起 始 实验 材 料。

18、实 时 荧 光 定 量 技 术 的 定 量 方 法 标 准 曲 线 法 的 相 对 定 量 法 此 方 法 中 定 量 的 表 达 是 相 对 于 某 个 参 照 物 的 量 而言 的 ， 因 此 相对 定 量 的标 准 曲 线就 比 较 容 易制 备 ， 对 于 所 用 的 标 准 品 只 要 知 道 其 相 对 稀 释 度 即 可 。在 整 个实 验 中样 本 的 靶序 列 的量 来 自于 标 准曲 线 ， 最 终 必 须除 以 参 照 物 的 量 ， 即 参 照 物 是 ， 的 样 本 ， 其 它 的样 本 为参 照 物 量 的的 倍 。在 实 验 中为 在 反 应 中同 时 扩增 一

19、内源 控 制 物 ， 如 在 基因 表 达 研 究 中 ， 内 源 控制 物 常为 一 些管 家 基因 。 比 较 法 的 相 对 定 量 法 比 较 法 与标 准 曲线 法 的相 对 定 量法 的 不 同 之 处 在于 其 运用 了 数 学公 式 来 计算 相 对 量 ， 前 提 是 假 设 每 个 循 环 增 加一 倍 的 产 物 数 ， 在 反 应 的 指 数期 得到 值 来反应 起始 模板的 量。但 是此方 法 是 以靶 基因 和内 源控 制物 的扩 增效 率基 本一 致为 前 提 的 ， 效 率的 偏移将 影响 实际拷 贝数 的估计 。 标 准 曲 线 法 的绝 对 定 量 法 此

20、方 法 与 标 准 曲 线 法 的 相 对 定 量 的 不 同 之 处 在于 其 标 准品 的 量 是 预先 已 知 的。 质 粒 和 体 外 转 入 的 常 作 为 绝 对 定 量 标 准 品 的 制 备 之 用 。 标 准 品 的 量 可 根 据 的 吸 光 度 值 并 用 或 的 分 子量 来 转 换成 其 拷贝 数 来确 定 。 实 时 荧 光 定 量 技 术 存 在 的 问 题 及 应 用 前 景 在 技 术 中 ， 无 论 是 相 对 定 量 还 是 标 准 曲 线 定 量方 法 仍 存 在 一 些 定 量 方 法 普 遍 有的 问 题 有侍 解 决。 在 标 准曲 线 定 量 中

21、 ， 标 准 品 的 制 备是 一 个必 不 可少 的 过程 。目前 由 于无 一 统 一 标 准 ， 各 个实 验 室所 用 的 生成 标 准 曲 线的 样 品 各 不 相 同 ， 致 使 实 验 结 果 缺 乏 可 比 性 。 此 外 ， 研 究 时 ， 受 到 不 同 样本 存 在 不 同 的 逆 转 录 （ ） 效 率 的限 制 。在 相对 定 量中 ， 其前 提 是假 设 内 源 控 制物 不 受实 验 条 件的 影 响 的 ， 合 理 地选 择 合 适 的 不 受 实 验 条 件 影 响 的 内 源 控 制 物 也 是 实 验 结 果 可 靠 与 否 的 关 键。 另 外 ， 与

22、传统 的 技 术 相 比 ， 的 不 足 之 处 是 （ ） 由 于 运 用 了 封 闭 的 检 测 ， 减 少 了 扩 增 后 电 泳 的 检 测 步 骤 ， 因 此 也 就 不 能监 测 扩 增产 物 的大 小 ； （ ） 因 为 荧光 素 种 类 以 及 检 测光 源 的局 限 性 ， 从 而 相对 地 限 制了 实 时 荧 光 定 量 的 复 合 式 检 测 的 应 用 能 力 ； （ ） 目 前 实 验 成 本 比 较 高 ， 从 而 也 限 制 了 其 广 泛 的应 用 。 随 着 技 术 不 断 改进 和 发 展 ， 目 前 已 成 为科 研 的 主要 工 具 ， 使得 研 究

23、人员 又 多 了 一 种 比 较简 单 且自 动 化的 研 究 手段 ， 该 技术 未 来 的 应 用 前景 是 非常 广 阔 的。一 方面 ， （ 下转第 页 ） ， 年第 期 金振华等 ： 生物传感器及其实际应用 （ ） ： 它 生物 传 感检 测 仪表 将 形 成国 内 市 场 。 ， ， ， ， 生 物传 感 产 品将 在 食 品 、奶 制 品 、饮 料业 原 料 （ ） ： 质 量 控 制 、生 产 加 工 、产 品 卫 生 质 量 控 制 的 细 菌 总 数 检测 方 面得 到 利用 ， 并形 成 市场 。 水 质检 测 将 成 为 生物 传 感 器 在 环 境 监测 应 用 中

24、最受 关 注并 取 得突 破 的项 目 。 参 考 文 献 ， ， ， ， 金 振华 ， 陆建 荣 ， 杨建 发明 专利“含 虫光 素酶基 因的 新型 菌株 及 虫光素 酶的生 产方法 ” 年 ， 专 利号 ： ， （ ） “ ： ” ， ， ， ： ， ” ， ， ， ， ： ! （ 上接第 页 ） 技 术 与 其 它 分 子 生 物 学 技 术 相 结 合 使 定 量 极 微 量 的 基因 表 达或 拷 贝数 成 为可 能 。另 一方 面 ， 荧 蔡 霞 现 代诊断 与治疗 ， ， （ ） ： 到 商业 检 测的 全 方位 应 用 。 欧阳松 应 ， 杨冬 ， 欧 阳红生 ， 等 生 命的

25、化学 ， ， （ ） ： 总 的 来 说 ， 定 量 技 术 具 有 以 下 发 展 趋 势 ： 张蓓 国外 医学 临 床生 物化 学与 检验 学分 册 ， ， （ ） ： 定 量 水 平 从 粗 略 定 量 、半 定 量 到 精确 定 量 、绝 对 定 量 ； 定 量 过程 中 参照 物 的 选择 从 单 纯外 参 照 非 竞争 ， ， ， ： 测 方法 由 手工 检 测、半 自 动检 测 发 展到 成 套 设 备检 ， ， ， ， ， （ ） ： 测 ， 且检 测 效 率及 自 动 化 程度 越 来 越 高 。 的 研 究工 具 。 可 以 这 么说 ， 现 在 用 到 的 地 方 ， （

26、 ） ： ， ， ， ， （ ） ： 参 考 文 献 傅占江 国 外医学 临 床生物化学与检 验学分册 ， ， （ ） ： ! 中国畜禽种 业杂志 （ 月刊 ） 中国 畜 禽 种业 杂志 ， 由 中 华 人 民共 和 国 农 业部 主 研 究 、产 业 经济 、技术 交 流 、畜 禽 良种 、 产品 展 台 、采 撷 企 管 ， 中 国农 业 科学 院农 业 信息 研 究所 主 办 ， 是国 家 专 业种 业、媒 体广 角、读者 之窗 、供求信 息等 。 畜 禽期 刊 ， 面向 国内 外公开 发行 的正 式出版 物。国内 刊号 ： 全国 各地 邮政局 （ 所 ） 均 可订阅 邮 发代号 ： ， ， 国 际 刊 号 ： ， 国 外 代 号 ： 定 价 ： 每 期 元 ， 全 年 元 。 直张 华 ， 许 叔祥 中华检 验医学 杂志 ， ， （ ） ： 王 宁 国 外医 学 临 床生 物化 学与 检 验学 分册 ， ， （ ） ： 光 标 记 核 酸 化 学 技 术 和 寡 核 苷 酸 探 针 杂 交 技 术 的