石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调查_邹苗.docx
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1、 分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感 染调查 Investigations and Researches on Pathogenic E.coli and intestinal parasite of Elaphurus Davidianus in Shishou Milu National Nature Reserve 研 究 生 . 邹苗 学 号:2010302110213 指 导 教 师 : 郭 定 宗 教 授 指 导 小 组 : 郭 定 宗 教 授 丁 明 星 教 授 邓 干 臻 教 授 李 家 奎 教 授 周东海副教授 杨世锦髙级工
2、程师 专业:临床兽医学 研究方向:动物营养代谢病 获得学位名称:农学硕士 获得学位时间 : 2014年 6月 华中农业大学动物医学院 二一四年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 否 如需保密,解密时间 年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 .尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料,指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明,并表示了谢
3、意。 研究生签名: 时间:年;月吝曰 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定,即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存提交论文的印刷版和电子版 , 并提供目录检索和阋览服务,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容,为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务,同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注:保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交 保密的论 文)在解密后适用于本授权书 . 学位论文使用授权书 签名曰期:逆,争
4、年厶月善曰 签名曰期: -(年各月 I 注:请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调查 目录 m . i ABSTRACT . : . iii 綱嫌 . v 第一部分文献综述 . 1 1麋鹿种群相关研究 . 1 1.1麋鹿的历史分布及数量 . 1 1.2中国麋鹿种群发展现状 . 1 1.3石首麋鹿保护区概况 . 2 1.3.1石首麋鹿自然保护区种群动态 . 3 1.3.2石首麋鹿栖息地生境变化研究 . 4 1.3.3石首麋鹿种群密度制约的困扰 . 6 2麋鹿疾病概述 . 6 2.1鹿科动物寄生虫疾病 . 7 2.1.1吸虫病 . 7 2.1
5、.2孢子虫病 . 8 2.1.3蜱虫病 . 8 2.2鹿科动物细菌疾病 . 9 2.2.1大肠杆菌病 . 9 2.2.2产气荚膜梭菌病 . 10 2.3其它鹿科动物疾病概述 . 11 2.3.1 驯鹿 . 11 2_3.2梅花鹿 . 12 2.4麋鹿疾病防控研究 . 13 第二部分石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌的分离鉴定 . 14 1材料与方法 . 14 1.1实验材料 . 14 I 华中农业大学 2014届硕士研究生学位(毕业 ) 论文 1.1.1培养基及生化鉴定管 . 14 1.1.2药敏试纸 . .14 1.1.3实验动物 . 14 1.1.4 PCR试剂与扩增引物 . . . 15 1.
6、1.5 主要仪器 . 16 1.2实验方法 . . . 16 1.2.1细菌的分离纯化 . 16 1.2.2细菌的形态学观察 . 16 1.2.3分离菌株的生理生化试验 . 17 1.2.4分离菌株的 16SrRNAPCR鉴定 . 17 1.2.5分离菌株的小鼠致病性试验 . 18 1.2.6分离菌株的药敏试验 . 18 1.2.7分离细菌 PCR模板的制备 . 19 1.2.8毒力基因的 PCR检测 . 19 2结果 . 20 2.1死亡麋鹿剖检观察 . 20 2.2细菌形态观察 . 20 2.3细菌生化鉴定结果 . 21 2.4细菌 16s rDNA鉴定结果 . 22 2.5小鼠致病力试验
7、 . 22 2.6大肠杆菌毒力基因检测结果 . 22 2.7药敏试验结果 . 24 3讨论: . 24 第三部分石首保护区麋鹿消化道寄生虫感染调査 . 27 1材料与方法 . 27 1.1粪 样采集及编号 . 27 1.2实验仪器 . 27 1.3检查方法 . 27 石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调査 1.3.1沉淀集卵法 . 27 1.3.2饱和食盐水浮聚法 . 27 1.3.3尼龙筛集卵法 . 28 1.3.4卵囊检测法 . 28 1.3.5虫卵形态记录与鉴别 . . 28 1.3.6虫卵计数 . 28 2结果 . 29 2.1麋鹿粪便中检出的寄生虫卵及其形态观察 . 2
8、9 2.2麋鹿粪便虫卵感染情况 . 31 2.3麋鹿消化道寄生虫种类及感染强度 . 32 2.4麋鹿前后盘吸虫 EPG计数 . . . . . 32 3讨论 . 33 . 35 it . 41 石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调査 摘要 湖北石首麋鹿国家级自然保护区是我国三大麋鹿保护基地之一,区内麋鹿全部 实现自然放养,现已形成全球最大的野生麋鹿种群。但在 2010年前后,由于疫病的 爆发,区内麋鹿出现大规模死亡(张林源等, 2011)。本研究针对保护区内麋鹿致病 菌及寄生虫的感染情况,对保护区内麋鹿的潜在病原进行调查,旨在为麋鹿疾病防 控工作提供一定依据。 大肠杆菌为条件致病
9、菌,在麋鹿机体免疫力下降时,会对麋鹿的健康构成威胁。 本研究通过染色镜检、生化鉴定、 16SrDNAPCR、 小鼠毒力试验等方法从麋鹿心、 肝、脾、肺等病料中分离到 15株致病性大肠杆菌。采用 Kirby-Bauer纸片法,选用 14种常用抗生素 对分离得到的 15株致病性大肠杆菌进行药敏试验,结果显示,分 离到的 15株大肠杆菌对庆大霉素、卡那霉素、头孢唾林的高敏度均达到了 100%; 其次是对氯霉素、新霉素以及链霉素,高敏度均超过 60%;耐药性方面,对克林霉 素和磺胺嘧啶的耐药度分别为 80%和 60%。本研究为麋鹿致病性大肠杆菌的快速鉴 定提供了方法,同时对针对该病治疗药物的选择有一定
10、指导作用。此外,本研究基 于相关文献报道,使用粘附素类、铁转运系统类、血清类、毒素类的 fimH、kps II、 papC、 tsh、 iss、 iucD、 irp2、 cvi/cva、 vat、 sta、 traTa、 ompA 等基因的相应引物对 15株分离到致病性大肠杆菌进行了毒力基因的 PCR扩增检测。按照扩增频率排列 依次为 ompA(100.00%)、 traTa(80.00%)、 iss(80.00%)、 iucD(60.00%)、 irp2(53.33%)、 sta(33.33%)、 vat(20.00%), 其中 ompA、 traTa、iss、 irp2 等基因的扩增频率较
11、高。 本次对麋鹿致病性大肠杆菌毒力基因的研究,为进一步探讨麋鹿大肠杆菌病的致病 机理奠定了基础。 寄生虫病为野生动物的常见疾病,由于保护区内麋鹿所处自然环境复杂,寄生 虫病病原种类繁多且分布广泛,当感染数量到达一定程度后,寄生虫病常造成麋鹿 机体消瘦及机体免疫力下降,严重时甚至造成其大量死亡 ( 沈华, 2007)。本课题采 用沉淀集卵法、饱和食盐水浮聚法、饱和糖水离心法、抗酸染色法等对保护区内 145 份麋鹿粪便进行了肠道寄生虫卵的检测。结果显示:寄生虫卵的总体检出率方面, 华中农业大学 2014届硕士研究生学位(毕业 ) 论文 吸虫卵最高,达 67.58%;线虫卵、绦虫卵 和球虫卵相对较少
12、,分别为 17.24%、 15.86% 及 13.80%。前后盘吸虫卵的检出率高达 53.10%,其次为带绦虫卵、蛔虫卵、艾美 尔球虫卵,分别为 15.86%、13.10%和 8.28%。 关键词:麋鹿 ;致病性大肠杆菌 ;毒力基因 ;寄生虫 石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调査 ABSTRACT Hubei Shishou Milu National Nature Reserve, one of the three bases of Pere David*s deer in China, has the worldfs largest wild deer population
13、s. But after 2010, the outbreaks of epidemic diseases lead to mass deaths of Pere Davidfs deer (Zhang Linyuan , 2011). This study surveyed the potential pathogens by isolating and identifying the pathogenic bacterium and parasite of Pere Davids deer, and designed to provide a reference for disease p
14、revention. E. coli as a conditioned pathogen , always pose a threat to the health of Pere Davids deer. Tissue samples were collected and plated onto agar media on this study. As a result, 15 pathogenic Escherichia coli in Pere Davidfs deer were isolated and identified by bacterial culture, biochemic
15、al assays and pathogenic test. According to the Kirby-Bauer disk diffusion method, drugs resistance of 15 pathogenic isolates were tested using 14 antibiotics. The highest sensitivity rate of 6 drugs was over 60%, which were gentamicin, kanamycin, cephalosporins, chloramphenicol, neomycin and strept
16、omycin.As for penicillin, vancomycin, clindamycin and sulfadiazine, they showed little effect on retarding bacterial growth. This study would provide reference for clinical use of drugs for Pere Davids deer. Besides, for exploring the pathogenesis of 15 pathogenic Escherichia coli in Pere Davids dee
17、r, 12 virulence genes (fimH, kps II? papC, tsh iss, iucD,irp2, vat and sat) which reported by Ewers .C were chosen to detect the virulence factors of the isolated Escherichia coli. Arranged in order of frequency according to a华中农业大学 2014届硕士研究生学位(毕业 ) 论文 Paranphistomum cervi T.pisiformis and Eimeriid
18、ae were deteted in the highest frequence. Besides, schistosomiasis and Cryptosporidium were never detected in all 145 fecal samples. Key words: Pere Davids deer, pathogenic Escherichia coli, virulence genes, parasitic diseases iv 石首保护区麋 鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调査 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文名称 CFU Colony forming uni
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- 石首 保护区 麋鹿 致病性 大肠杆菌 分离 鉴定 寄生虫 感染 调查 邹苗
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