肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌与大肠埃希氏菌O157：H7的快速检测方法 核酸等温扩增荧光检测方法 (征求意见稿).docx

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1、DB64宁夏回族自治区 地方标准DB 64/T肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌与肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌与 大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌 O157O157：H7H7 的快速检测方法的快速检测方法核酸等温扩增荧光检测方法核酸等温扩增荧光检测方法(征求意见稿)- - 发布- - 实施发 布DB64/TI前 言本标准是按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则编写。本标准由宁夏回族自治区食品检测研究院提出。本标准由宁夏回族自治区市场监督管理厅归口。本标准起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院，宁夏回族自治区食品药品审评查验中心。本标准主要起草人：邓军、

2、夏莉娟、高俊峰、冯秀娟、李雯、董川、赵艳 DB64/T1肉与肉制品中单核细胞肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌与大肠埃希氏菌增生李斯特氏菌与大肠埃希氏菌 O157O157：H7H7 的快速检测方法的快速检测方法核酸等温扩增荧光检测方法1 范围本标准规定了肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌O157：H7的环介导恒温核酸扩增（LAMP）法。本标准适用于肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌O157：H7的的定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不住日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适

3、用于本文件。 GB 4789.30 食品安全国家标准 食物微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验GB4789.36 食品安全国家标准 食物微生物学检验 大肠埃希氏菌O157：H7/NM 检验GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室 生物安全通用要求GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测SN/T 1193 基因检测实验室技术要求3 生物安全措施按照GB 19489中的有关规定执行。4 防污染措施防止污染措施应符合GB/T 27403的规定。5 缩略语甜菜碱：甘氨酸三甲胺内盐Bst 酶Bst DNA polymerase(large frag

4、ment):Bst DNA 聚合酶（大片段）DB64/T 2DNA(deoxyribonuclelc add)：脱氧核糖核酸dNTP（deoxyribonucleoside triphosphate）：脱氧核苷三磷酸LAMP（loop-mediated isothermal amplification）：环介导恒温扩增TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚6 原理根据单核细胞增生李斯特氏菌特有的靶序列 vir R 基因（参见附录 A）设计一套特异性引物，包括外引物 F3，外引物 B3，内引物 FIP，内引物 BIP。根据大肠埃希氏菌 O157：H7 特有的靶序列 rfbE基因序列（参见附录

5、 B）设计一套特异性引物，包括外引物 1，外引物 2，内引物 1，内引物 2，环状上游引物 LF 和环状下游引物 LB。分别特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用 Bst 酶启动循环链置换反应。Bst 聚合酶具有强链置换能力，能在 63这一恒温条件下实现对目标基因的扩增，其最大的特点就是在扩增过程中能产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的寡核苷酸结构（即类似花椰菜的茎环结构） ，在反应体系中添加的染色剂（SYBR Green）能结合到扩增出来的 DNA 的小沟处，当染色剂与 DNA 结合在一起的时候就能被激发出荧光，从而达到检测目的基因是否得到扩增，根据Ct 值，判断待检样品中是否存在单核细

6、胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌 O157：H7。7 试剂与材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 GB/T 6682 中水的要求。 7.1 李氏增菌肉汤（LB） ；EC 肉汤。7.2 引物PCR 反应使用的引物序列应符合表 1 的规定。表 1 PCR 反应使用的引物序列菌株目标基因引物名称序列(5-3)扩增片段大小（bp）F3GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTTB3ACAAGACTTCACCAATCCAFIPCCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG单核细胞增生李斯特氏菌femA基因BIPTAAGTCTCTTTG

7、CAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG216DB64/T3F3GGTGGAATGGTTGTCACGAB3TGGACTTGTACAAGACTGTTGAFIPAACGTCATGCCAATATTGCCTATGTTTTTATGACAAAACACTTTTGACCGTBIPGGATGACAAATATCTGCGCTGCTATTTTTTCAGCAATTTCACGTTTTCGTGATATLFCAGCTAATCCTTGGCCTTTAAAAG大肠埃希氏菌O157：H7fimI基因LBTAGCCCAGTTAGAACAAGCTGAT2397.3 DNA 提取试剂：细菌基因组 DNA 提取

8、试剂盒。 7.4 BstDNA 聚合酶：酶浓度 8U/。7.5 dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGTP，每种核苷酸浓度 10mmol/L。7.6 10ThermoPol 缓冲液含：0.2mol/L Tris HCI，0.1mol/L 氯化钾，0.1mol/L 硫酸铵，20mol/L 硫酸镁，1%TritonX-100。7.7 硫酸镁：50mmol/L。7.8 甜菜碱：5mol/L。 7.9 显色液：SYBR Green荧光染料，0.01mM。 7.10 阳性对照：单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株(ATCC19115)、大肠埃希氏菌 O157：H7 标准菌株（ATCC43888） 。

9、7.11 1.5mL 塑料离心管，PCR 八联管。7.12 单核细胞增生李斯特氏菌 LAMP 检测试剂盒大肠埃希氏菌 O157：H7 LAMP 检测试剂盒，可选，参照试剂盒说明书操作，见附录 C，附录 D。8 仪器与设备8.1 无菌玻璃器皿。8.2 恒温培养箱：361，301。8.3 移液器：量程 0.510；量程 10100；量程 1001000。DB64/T 48.4 高速台式冷冻离心机：7000 转。8.5 加热模块：1001。8.6 计时器。8.7 荧光定量 PCR 仪。9 检测程序DB64/T510 操作步骤10.1 样品制备与增菌培养 按照 GB 4789.30-2016、GB 4

10、789.36-2016 的方法进行样品制备和培养。单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株直接接种到 BHI 培养基，301过夜培养；大肠埃希氏菌 O157：H7 标准菌株直接接种到BHI 培养基，361过夜培养，做阳性对照。10.2 模板 DNA 的制备直接取增菌液 100加到 1.5mLDNA 提取管中，涡旋震荡混匀，100条件下热浴 5-10 分钟。3000 转离心 3min，上清液即为模板 DNA，所有处理后的 DNA 模板直接用于 PCR 反应或暂存于 4并当天进行 PCR 反应；否则，应在-20以下保存备用（1 周内） 。也可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌 DNA，按照说明书进行操作。若长期

11、保存须存放于-20或-80冰箱。10.3 环介导恒温核酸扩增 10.3.1 扩增试剂准备在试剂配制区进行，在低温条件下进行体系配制。单核细胞增生李斯特氏菌每个样品测试反应体系配制如下(25L 反应体系)：组份工作液浓度加样量（L）反应体系终浓度ThermoPol 缓冲液102.51外引物 1（F3）20mmol/L0.250.2mmol/L外引物 2（B3）20mmol/L0.250.2mmol/L内引物 1（FIP）20mmol/L1.00.8mmol/L内引物 2（BIP）20mmol/L1.00.8mmol/LdNTPs10mmol/L4.01.6mmol/L硫酸镁50mmol/L1.0

12、2.0mmol/L甜菜碱5mmol/L4.00.8mmol/LDB64/T 6Bst DNA 聚合酶8U/0.50.16U/显色液0.01mM0.5-DNA 模板-1-去离子水-9-大肠埃希氏菌 O157：H7 每个样品测试反应体系配制如下(25L 反应体系)：组份工作液浓度加样量（L）反应体系终浓度ThermoPol 缓冲液102.51外引物 1（F3）20mmol/L0.250.2mmol/L外引物 2（B3）20mmol/L0.250.2mmol/L内引物 1（FIP）20mmol/L1.00.8mmol/L内引物 2（BIP）20mmol/L1.00.8mmol/L环状上游引物（LF）

13、20mmol/L0.50.4mmol/L环状下游引物（LB）20mmol/L0.50.4mmol/LdNTPs10mmol/L4.01.6mmol/L硫酸镁50mmol/L1.02.0mmol/L甜菜碱5mmol/L4.00.8mmol/LBst DNA 聚合酶8U/0.50.16U/显色液0.01mM0.5-DNA 模板-1-去离子水-8-在各设定的PCR反应管中加入以上反应混合液，转移至样品制备区。DB64/T7注：阳性对照用单核细胞增生李斯特氏、大肠埃希氏菌 O157：H7 的 DNA 作为模板，阴性对照用不含相应成分的 DNA 样品作为模板，空白对照用灭菌水作为模板。10.3.2 加样

14、在样品制备区进行。在各设定的PCR反应管中分别加入制备好的模板DNA溶液，盖紧管，离心 5 s10 s。10.3.3 反应过程在扩增区进行。将10.3.2中离心后的PCR反应管放入实时荧光定量PCR检测系统内，记录样本摆放顺序，63扩增45min。检测结束后，根据扩增曲线和起峰时间判定结果。10.3.4 空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次扩增反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。 空白对照设为以灭菌水替代 DNA 模板。 阴性对照以提取非目标菌 DNA 代替模板 DNA。 阳性对照制备：将单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株接种于 BHI 中 30培养过夜、大肠埃希氏菌 O157：H7 标准菌株

15、接种于 BHI 中 36培养过夜，按 10.2 提取模板 DNA 作为 LAMP 反应的模板。10.3.5 质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a)空白对照：曲线为直线，无“S”型扩增曲线；b)阴性对照：曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线；c)阳性对照：呈“S”型扩增曲线，且检测样本出峰时间45min。11 结果判定与表述11.1 结果的判定11.1.1 有效性原则阴性对照：曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线；阳性对照：呈“S”型扩增曲线。11.1.2 样品DB64/T 8若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性；若无“S”型扩增曲线，则判为阴性。11.2 结果的表述 结果表述

16、为“检出单核细胞增生李斯特氏菌、检出大肠埃希氏菌O157：H7。”和“未检出单核细胞增生李斯特氏菌、未检出大肠埃希氏菌O157：H7。”12 废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后高压灭菌，121，30min。附 录 A（资料性附录）单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李斯特氏菌 vi r R 基因序列基因序列(accession no. DQ449868. 1)1 tttttcttga accaagaagc tacaagactt caccaatcca tacgtgtaca cagaaaagcg61 ctgattgctt ttttacttta tcatgcaagt gcgaacgtcg gtcaa

17、ttgca aagagactta121 aaactagcct gtgccaaagc atttttacat tataaaacca aaacggctaa ttatatatta181 atcgaacaag atgacttgcc tatccacgtt caaaaaggtt tactccactt aaaagacgaa241 ccagaaaaat taaat_DB64/T9DB64/T 10附 录 B大肠杆菌大肠杆菌 01570157 靶基因序列靶基因序列(accession(accession no.no. AF163332.1)AF163332.1)1 gttctaaata taaaggtaaa ta

18、tgtgggaa catttggaga tatttctact tttagctttt61 ttggaaataa aactattact acaggtgaag gtggaatggt tgtcacgaat gacaaaacac121 tttatgaccg ttgtttacat tttaaaggcc aaggattagc tgtacatagg caatattggc181 atgacgttat aggctacaat tataggatga caaatatctg cgctgctata ggattagccc241 agttagaaca agctgatcat tttatatcac gaaaacgtga aatcg

19、ctgat atttataaaa301 aaaatatcaa cagtcttgta caagtccaca aggaaagtaa agatgttttt cacacttatt361 ggatggtctc aattctaact aggaccgcag aggaaagaga ggaattaagg aatcaccttg421 cagataaact catcgaaaca aggccagttt tttaccDB64/T11附 录 C（资料性附录）单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒B.1 试剂盒组成每个试剂盒可做24个反应（25L/反应），包括表B.1的成分:DB64/T 12表表 B.1B.1组分名称组

20、分名称规格规格数量数量反应液550L1 支Bst DNA 聚合酶30L1 支密封液500L1 支阳性对照20L11 支支阴性对照20L11 支支B.2 说明B. 2. 1 试剂盒需于-20保存。B.2.2 反应液液中含有反应所需dNTP混合液、引物、缓冲液、核酸染料等。反应液应避光保存。B.3 功能本试剂盒可用于单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定。B.4 使用时的注意事项B.4.1 请严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。B.4.2 反应液中的成分对光敏感，应避光保存。反复冻融可能降低试剂盒灵敏度，请按检测频次将反应液以适当体积分管保存。DB64/T13附 录 D

21、（资料性附录）大肠埃希氏菌O157：H7LAMP检测试剂盒B.1 试剂盒组成每个试剂盒可做24个反应（25L/反应），包括表B.1的成分:表表 B.1B.1组分名称组分名称规格规格数量数量反应液550L1 支Bst DNA 聚合酶30L1 支密封液500L1 支DB64/T 14阳性对照20L11 支支阴性对照20L11 支支B.2 说明B. 2. 1 试剂盒需于-20保存。B.2.2 反应液液中含有反应所需dNTP混合液、引物、缓冲液、核酸染料等。反应液应避光保存。B.3 功能本试剂盒可用于大肠埃希氏菌O157：H7的鉴定。B.4 使用时的注意事项B.4.1 请严格按照操作步骤操作，试剂配制

22、和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。B.4.2 反应液中的成分对光敏感，应避光保存。反复冻融可能降低试剂盒灵敏度，请按检测频次将反应液以适当体积分管保存。DB64/T15肉与肉制品中肉与肉制品中单单核核细细胞增生李斯特氏菌与大胞增生李斯特氏菌与大肠肠埃希氏菌埃希氏菌O157： ：H7 的快速的快速检测检测方法核酸等温方法核酸等温扩扩增增荧荧光光检测检测方法方法地方地方标标准准编编制制说说明明一、一、 工作简况工作简况（1 1）任务来源任务来源食源性致病菌是引起食品安全问题的重要因素，单核细胞增生李斯特氏菌与大肠埃希氏菌O157：H7 是肉与肉制品中常见的食源性致病菌。其中单核细胞增生李

23、斯特氏菌（Listeria monocytogens，LM，简称为单增李斯特氏菌）生命力顽强，生长温度范围较广，是最致命的食源性病原体之一。世界各地每年均有报道由该菌爆发引起的食品安全事件，我国进出口每年也发生多起从国外引进的食物被检出该菌而将其退回的事例。我研究院在完成国家指令性任务的检测过程中发现动物性食品中时常检出单核细胞增生性李斯特氏菌。大肠埃希氏菌 O157:H7（Escherichia coli O157）是一种出血性致病性大肠杆菌，该病的感染具有易爆发流行、强致病性、高致死率等特点。目前检测食源性致病菌手段主要采用国标方法，如前增菌、分离、培养、生化鉴定等，操作繁琐，检测周期长，

24、每次只能检出一种细菌，一般要 7 天才能给出检测结果，且敏感度低、特异性差，而且对检测结果难以判定，经常因人员的因素造成结果的假阴性和假阳性。基于国标方法的诸多不足，尤其不能适应现代快速检测的要求，需要开发更好更快更可靠的检测方法。环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP）是近年来发展出来的一种新颖的核酸体外等温扩增技术，该技术具有简单、快速、高效、特异性强、价格低廉等特点，已经应用于病原菌检测、转基因食品检测、医学应用等诸多领域。我研究院拟将荧光与环介导等温扩增技术结合到一起，根据单核细胞增生李斯特氏菌特有的靶序列 vir R

25、 基因（Genbank DQ449868.1）设计特异性引物,根据大肠埃希氏菌 O157 的 rfbE 基因序列(Genbank AF163332.1)为靶序列设计特异性引物利用实时荧光 PCR 仪实时监测产物扩增情况，根据有无“S”型扩增曲线判定结果，全程耗时短，成本低，快速准确。为了提高检验数据的准确性及检测报告的权威性，我研究院提出建立肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌与大肠埃希氏菌 O157：H7 的快速检测方法的地方检验方法标准，一可辅助国标方法对检验结果进行准确判定，加大检测的可信度；二可为生产企业提供准确、快速、可靠、简便的检测方法。我研究院经试验验证后，经宁夏回族自治区市场监督

26、管理厅批准立项，制定肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌与大肠埃希氏菌 O157：H7 的快速检测方法-核酸等温扩增荧光检测方法检验方法的地方标准。DB64/T 16（二）标准起草单位和人员（二）标准起草单位和人员起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院。主要起草人员：邓军 宁夏食品检测研究院微生物检验科；夏莉娟 宁夏食品药品审评查验中心；高俊峰 宁夏食品检测研究院微生物检验科；冯秀娟 宁夏食品检测研究院微生物检验科；李雯 宁夏食品检测研究院质量管理科；董川 宁夏食品检测研究院办公室；赵艳 宁夏食品检测研究院质量管理科。（三）主要工作过程（三）主要工作过程1、成立标准起草小组。2、查阅肉与肉制品中

27、单核细胞增生李斯特氏菌与大肠埃希氏菌 O157：H7 检测技术相关的文献资料。3、对肉与肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌与大肠埃希氏菌 O157：H7 检验方法引物特异性、准确度、灵敏度等项目进行实验，汇总实验数据，确定实验方案。4、编写标准编制说明和起草标准文本，召集起草小组全体成员讨论通过该地方标准初稿。5、请自治区内的相关专家对标准的初稿进行审定，根据专家提出的意见修改后形成送审稿。二、标准编制原则和标准主要内容的确定二、标准编制原则和标准主要内容的确定本标准的编制遵循有利于食品产业的健康发展，能辅助传统的细菌培养法提高检验结果的可靠性，为生产企业提供准确、快速、可靠、简便的检测方法并为应对食品安全事件提供强有力的技术保障。符合国家的法律、法规和强制性标准规定的原则。本标准编写格式按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规定编写。方法是经过试验条件摸索，方法验证、引物特异性、准确度和灵敏度试验后形成检测方法标准。方法验证过程具体内容详见附件 1。三、采用国际标准或国外先进标准程度有关情况的说明三、采用国际标准或国外先进标准程度有关情况的说明本标准无采用。DB64/T17四、标准性质的建议四、标准性质的建议作为检验方法标准，建议本标准作为推荐性地方标准发布和实施。宁夏回族自治区食品检测研究院标准起草小组2019 年 08 月 28 日