食品中沙门氏菌与金黄色葡萄球菌 的快速检测方法 核酸等温扩增荧光检测方法 (征求意见稿).docx

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1、DB64宁夏回族自治区 地方标准DB 64/T食品中沙门氏菌与金黄色葡萄球菌食品中沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的快速检测方法的快速检测方法核酸等温扩增荧光检测方法核酸等温扩增荧光检测方法(征求意见稿)- - 发布- - 实施发 布DB64/TI前 言本标准是按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则编写。本标准由宁夏回族自治区食品检测研究院提出。本标准由宁夏回族自治区市场监督管理厅归口。本标准起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院，宁夏回族自治区食品药品审评查验中心。本标准主要起草人：冯秀娟、夏莉娟、邓军、高俊峰、董川、赵艳、李雯 DB64/T1食品中沙门氏

2、菌和金黄色葡萄球菌的快速检测方法核酸等温扩增荧光检测方法1 范围本标准规定了食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的环介导恒温核酸扩增（LAMP）法。本标准适用于食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不住日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.4 食品安全国家标准 食物微生物学检验 沙门氏菌检验GB4789.10 食品安全国家标准 食物微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室 生物安全通用要

3、求GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测SN/T 1193 基因检测实验室技术要求3 生物安全措施按照GB 19489中的有关规定执行。4 防污染措施防止污染措施应符合GB/T 27403的规定。5 缩略语甜菜碱：甘氨酸三甲胺内盐Bst 酶Bst DNA polymerase(large fragment):Bst DNA 聚合酶（大片段）DNA(deoxyribonuclelc add)：脱氧核糖核酸dNTP（deoxyribonucleoside triphosphate）：脱氧核苷三磷酸DB64/T 2LAMP（loop-mediated isothermal am

4、plification）：环介导恒温扩增TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚6 原理根据金黄色葡萄球菌特有的靶序列femA基因（参见附录A）设计一套特异性引物，包括外引物F3，外引物B3，内引物FIP，内引物BIP。根据沙门氏菌fimI基因序列（参见附录B）设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2，环状上游引物LF和环状下游引物LB。特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应。Bst聚合酶具有强链置换能力，能在63这一恒温条件下实现对目标基因的扩增，其最大的特点就是在扩增过程中能产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的寡核苷酸结构（即类似花椰菜

5、的茎环结构），在反应体系中添加的染色剂（SYBR Green）能结合到扩增出来的DNA的小沟处，当染色剂与DNA结合在一起的时候就能被激发出荧光，从而达到检测目的基因是否得到扩增，根据Ct值，判断待检样品中是否存在沙门氏菌或金黄色葡萄球菌。7 试剂与材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 GB/T 6682 中水的要求。 7.1 缓冲蛋白胨水（BPW） ；7.5%氯化钠肉汤；无菌生理盐水。7.2 引物PCR 反应使用的引物序列应符合表 1 的规定。表 1 PCR 反应使用的引物序列菌株目标基因引物名称序列(5-3)扩增片段大小（bp）F3TTTAACAGCTAAAGAGTT

6、TGGTB3TTTTCATAATCRATCACTGGACFIPCCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGTTTTTCAGATAGCATGCCCATACAGTC金黄色葡萄球菌femA基因BIPACAATAATAACGAGGTCATTGCAGCTTTTCTTGAACACTTTCATAACAGGTAC231沙门氏菌fimI基因F3CACTAAATCCGCCGATCAA262DB64/T3B3CAACGGTGAGGAGGTATTATCFIPTTCGGATCGCAGTCATTCAGGCGATTGGTGATACGACCGBIPGGTCAGGCAGATAACACCAACATTGCGGTGGTGCTAT

7、TATCLFTGGTGAAAGGCACCTGTGLBATTTGCTGGCTGTCTCCTC7.3 DNA 提取试剂：细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 7.4 BstDNA 聚合酶：酶浓度 8U/。7.5 dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGTP，每种核苷酸浓度 10mmol/L。7.6 10ThermoPol 缓冲液含：0.2mol/L Tris HCI，0.1mol/L 氯化钾，0.1mol/L 硫酸铵，20mol/L 硫酸镁，1%TritonX-100。7.7 硫酸镁：50mmol/L。7.8 甜菜碱：5mol/L。 7.9 显色液：SYBR Green荧光染料，0.01mM。

8、7.10 阳性对照：鼠伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50115)、金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC25923)。7.11 1.5mL 塑料离心管，PCR 八联管。7.12 金黄色葡萄球菌 LAMP 检测试剂盒，沙门氏菌 LAMP 检测试剂盒，可选，参照试剂盒说明书操作，见附录 C，附录 D。8 仪器与设备8.1 无菌玻璃器皿。8.2 恒温培养箱：361。8.3 移液器：量程 0.510；量程 10100；量程 1001000。8.4 高速台式冷冻离心机：7000 转。8.5 加热模块：1001。DB64/T 48.6 计时器。8.7 荧光定量 PCR 仪。9 检测程序10 操作步骤10.1 样品

9、制备与增菌培养 DB64/T5按照 GB 4789.4-2016、GB 4789.10-2016 的方法进行样品制备和培养。金黄色葡萄球菌标准菌株、沙门氏菌标准菌株直接接种到 BHI 培养基，361过夜培养，做阳性对照。10.2 模板 DNA 的制备10.2.1 增菌液模板 DNA 的制备直接取增菌液 100加到 1.5mLDNA 提取管中，涡旋震荡混匀，100条件下热浴 5-10 分钟。3000 转离心 3min，上清液即为模板 DNA；取上清液置-20可保存个月备用。10.2.2 可疑菌落 DNA 的制备用 1L 接种环刮取 Baird-Parker 琼脂平板上的可疑菌落，悬浮在 200L

10、0.85%灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于 13000r/min 离心 3min，收集上清液，取 2L 作为 PCR 检测的模板；所有处理后的 DNA 模板直接用于 PCR 反应或暂存于 4并当天进行 PCR 反应；否则，应在-20以下保存备用（1 周内） 。也可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌 DNA，按照说明书进行操作。若长期保存须存放于-20或-80冰箱。10.3 环介导恒温核酸扩增 10.3.1 扩增试剂准备在试剂配制区进行，在低温条件下进行体系配制。金黄色葡萄球菌每个样品测试反应体系配制如下(25L 反应体系)：组份工作液浓度加样量（L）反应体系终浓度ThermoPol 缓冲液1

11、02.51外引物 1（F3）20mmol/L0.250.2mmol/L外引物 2（B3）20mmol/L0.250.2mmol/L内引物 1（FIP）20mmol/L1.00.8mmol/L内引物 2（BIP）20mmol/L1.00.8mmol/LdNTPs10mmol/L4.01.6mmol/L硫酸镁50mmol/L1.02.0mmol/LDB64/T 6甜菜碱5mmol/L4.00.8mmol/LBst DNA 聚合酶8U/0.50.16U/显色液0.01mM0.5-DNA 模板-1-去离子水-9-沙门氏菌每个样品测试反应体系配制如下(25L 反应体系)：组份工作液浓度加样量（L）反应体

12、系终浓度ThermoPol 缓冲液102.51外引物 1（F3）20mmol/L0.250.2mmol/L外引物 2（B3）20mmol/L0.250.2mmol/L内引物 1（FIP）20mmol/L1.00.8mmol/L内引物 2（BIP）20mmol/L1.00.8mmol/L环状上游引物（LF）20mmol/L0.50.4mmol/L环状下游引物（LB）20mmol/L0.50.4mmol/LdNTPs10mmol/L4.01.6mmol/L硫酸镁50mmol/L1.02.0mmol/L甜菜碱5mmol/L4.00.8mmol/LBst DNA 聚合酶8U/0.50.16U/显色液0

13、.01mM0.5-DNA 模板-1-DB64/T7去离子水-8-在各设定的每个PCR反应管中加入以上反应混合液，转移至样品制备区。注：阳性对照用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的 DNA 作为模板，阴性对照用不含相应成分的 DNA 样品作为模板，空白对照用灭菌水作为模板。10.3.2 加样在样品制备区进行。在各设定的PCR反应管中分别加入制备好的模板DNA溶液，盖紧管，离心 5 s10 s。10.3.3 反应过程在扩增区进行。将10.3.2中离心后的PCR反应管放入实时荧光定量PCR检测系统内，记录样本摆放顺序，63扩增45min。检测结束后，根据扩增曲线和起峰时间判定结果。10.3.4 空白对照、阴

14、性对照、阳性对照设置每次扩增反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。 空白对照设为以灭菌水替代 DNA 模板。 阴性对照以提取非目标菌 DNA 代替模板 DNA。 阳性对照制备：将金黄色葡萄球菌标准菌株、沙门氏菌标准菌株接种于 BHI 中 36培养过夜，按 10.2 提取模板 DNA 作为 LAMP 反应的模板。10.3.5 质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a)空白对照：曲线为直线，无“S”型扩增曲线；b)阴性对照：曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线；c)阳性对照：呈“S”型扩增曲线，且检测样本出峰时间45min。11 结果判定与表述11.1 结果的判定11.1.1 有效性

15、原则阴性对照：曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线；DB64/T 8阳性对照：呈“S”型扩增曲线。11.1.2 样品若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性；若无“S”型扩增曲线，则判为阴性。11.2 结果的表述 结果表述为“检出金黄色葡萄球菌、检出沙门氏菌。”和“未检出金黄色葡萄球菌、未检出沙门氏菌。”12 废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后高压灭菌，121，30min。附 录 A（资料性附录）金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 femAfemA 基因序列（基因序列（accessionaccession no.AF144661no.AF144661）1 atgaagttta caaatttaac

16、agctaaagag tttggtgcct ttacagatag catgccatac61 agtcatttca cgcaaactgt tggccactat gagttaaagc ttgctgaagg ttatgaaaca121 catttagtgg gaataaagaa caataataac gaggtcattg cagcttgctt acttactgct181 gtacctgtta tgaaagtgtt caagtatttt tattcaaatc gcggtccagt gatcgattat241 gaaaatcaag aactcgtaca ctttttcttt aatgaattat caa

17、aatatgt taaaaaacat301 cgttgtctat acctacatat cgatccatat ttaccatatc aatacttgaa tcatgatggc361 gagattacag gtaatgctgg taatggttgg ttctttgata aaatgagtaa cttaggattt_DB64/T9421 gaacatactg gattccataa aggatttgat cctgtgctac aaattcgtta tcactcagtg481 ttagatttaa aagataaaac agcagatgac atcattaaaa atatggatgg acttagaa

18、aa541 agaaacacga aaaaagttaa aaagaatggt gttaaagtaa gatatttatc tgaagaagaa601 ctaccaattt ttagatcatt catggaagat acgtcagaat caaaagcttt tgctgatcgt661 gatgacaagt tttattacaa tcgcttaaaa tattacaaag accgtgtgtt agtgccttta721 gcgtatatca attttgatga atatattaaa gaactaaatg aagagcgtga tattttaaac781 aaagatttaa ataaagc

19、att aaaggatatt gaaaaacgtc ctgaaaacaa aaaagcgcat841 aacaagcgag ataacttaca acaacaactt gatgcaaatg agcaaaagat tgaagaaggt901 aaacgtctac aagaagaaca tggtaatgaa ttacctatct ctgctggttt cttctttatc961 aatccatttg aagttgttta ttatgctggt ggtacatcaa atgctttccg tcattttgcc1021 ggaagttatg cagtgcaatg ggaaatgatt aattatgc

20、at taaatcatgg cattgaccgt1081 tataatttct atggtgttag tggtaaattt actgaagatg ctgaagatgc tggtgtagtt1141 aaattcaaaa aaggttacaa tgctgaaatt attgaatatg ttggtgactt tattaaacca1201 agtaataaac ctgtttacac agcatatacc gcacttaaaa aagttaaaga cagaattttt1261 tagDB64/T 10附 录 B沙门氏菌沙门氏菌 fim I 特异基因序列特异基因序列(Accession no.AF0

21、83911.1)1 cctacgccgg tgagcgtgag tggcggtact attcatttcg aaggtaaact ggttaatgcg61 gcctgtgccg tcagcactaa atccgccgat caaacggtga cgttgggtca ataccgtacc121 gccagcttta cggcgattgg tgatacgacc gcacaggtgc ctttcaccat cgtcctgaat181 gactgcgatc cgaaagtggc ggccaccgct gccgttgctt tctctggtca ggcagataac241 accaacaata attt

22、gctggc tgtctcctct gcggataata gcaccaccgc aaccggcgtc301 gggattgaaa ttcttgataa tacctcctca ccgttgaagc cggacggcgc gaccttctcg361 gcgaagcagt cgctggttga aggcaccaat acgctgcgtt ttaccgcacg ctataaggca421 accgccgccg ctacgacgcc aggccaggct aatgccgacg ccacctttat catgaaatac481 gaataatccc gtcaggaaac gccagggaag aaagac

23、gcct caatggaaga ggctatcggg541 gataaaagag aacatacaga tgataaggaa aggcgcggcg ctagtggggc ttattttgat601 gtcgcccgtc attgcgcagc cggtaattgt ggagagcggg cgtgttcacc tgcgcggaca661 actggtcaat ggcDB64/T11附 录 C（资料性附录）金黄色葡萄球菌LAMP检测试剂盒B.1 试剂盒组成每个试剂盒可做24个反应（25L/反应），包括表B.1的成分:表表 B.1B.1组分名称组分名称规格规格数量数量反应液550L1 支DB64/T

24、12Bst DNA 聚合酶30L1 支密封液500L1 支阳性对照20L11 支支阴性对照20L11 支支B.2 说明B. 2. 1 试剂盒需于-20保存。B.2.2 反应液液中含有反应所需dNTP混合液、引物、缓冲液、核酸染料等。反应液应避光保存。B.3 功能本试剂盒可用于金黄色葡萄球菌的鉴定。B.4 使用时的注意事项B.4.1 请严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。B.4.2 反应液中的成分对光敏感，应避光保存。反复冻融可能降低试剂盒灵敏度，请按检测频次将反应液以适当体积分管保存。DB64/T13附 录 D（资料性附录）沙门氏菌LAMP检测试剂盒B.1

25、 试剂盒组成每个试剂盒可做24个反应（25L/反应），包括表B.1的成分:表表 B.1B.1组分名称组分名称规格规格数量数量反应液550L1 支Bst DNA 聚合酶30L1 支密封液500L1 支阳性对照20L11 支支阴性对照20L11 支支B.2 说明DB64/T 14B. 2. 1 试剂盒需于-20保存。B.2.2 反应液液中含有反应所需dNTP混合液、引物、缓冲液、核酸染料等。反应液应避光保存。B.3 功能本试剂盒可用于沙门氏菌的鉴定。B.4 使用时的注意事项B.4.1 请严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。B.4.2 反应液中的成分对光敏感，应

26、避光保存。反复冻融可能降低试剂盒灵敏度，请按检测频次将反应液以适当体积分管保存。DB64/T15食品中沙食品中沙门门氏菌与金黄色葡萄球菌的快速氏菌与金黄色葡萄球菌的快速检测检测方法方法核酸等温核酸等温扩扩增增荧荧光光检测检测方法地方方法地方标标准准编编制制说说明明一、一、 工作简况工作简况（1 1）任务来源任务来源食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因之一，是全球食品安全的核心问题。近年来，国内外食源性致病菌病事件频频发生，这些事件中沙门氏菌与金黄色葡萄球菌是主要的两种致病菌，由感染沙门氏菌而引起的腹泻等疾病几乎在所有国家都有发生。沙门氏菌与金黄色葡萄球菌在我国近 10 年来由微生物引起的食源

27、性疾病事件中的比例分别是 10.3%和 1.5%，这给人民的健康带来很大的潜在危胁。因此，能快速的对上述两种致病菌进行检测，才能快速应对此类食品安全突发事件。目前针对上述两种致病菌的检测手段主要依赖传统的细菌学培养法，该方法培养时间长、分型实验复杂、灵敏度低、对检测人员能力的要求较高，在实际工作中现有的国标检测方法工作量巨大、判断难度巨大、易受个人因素影响、进一步降低数据的可靠性，同时在很多突发事件中不能够很好的及时反映准确的数据。因此，建立快速高效的检测方法已刻不容缓。LAMP 技术作为一种基因检测技术,因其灵敏度高、特异性强以及操作简单等特点,将为食源性致病菌的检测搭建一个新的技术平台,尤

28、其在沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的快速检测上存在巨大潜力。本试验根据沙门氏菌的 fimI 基因序列(Genbank AF083911.1)为靶序列设计特异性引物,根据金黄色葡萄球菌的 femA 基因序列(Genbank AF144661)为靶序列设计特异性引物通过实时荧光 PCR 仪实时监测产物扩增情况，根据有无“S”型扩增曲线判定结果，全程耗时短，成本低，工作量少，快速准确。我研究院经试验验证后申请食品中沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的快速检测方法检验方法的地方标准，其一可辅助传统的细菌培养法提高检验结果的可靠性并为应对食品安全事件提供强有力的技术保障；其二为生产企业提供准确、快速、可靠、简便的检测方

29、法。我研究院经试验验证后，经宁夏回族自治区市场监督管理厅批准立项，制定食品中沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的快速检测方法-核酸等温扩增荧光检测方法检验方法的地方标准。（二）标准起草单位和人员（二）标准起草单位和人员起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院。主要起草人员：冯秀娟 宁夏食品检测研究院微生物检验科；DB64/T 16夏莉娟 宁夏食品药品审评查验中心；邓军 宁夏食品检测研究院微生物检验科；高俊峰 宁夏食品检测研究院微生物检验科；董川 宁夏食品检测研究院办公室；赵艳 宁夏食品检测研究院质量管理科；李雯 宁夏食品检测研究院质量管理科。（三）主要工作过程（三）主要工作过程1、成立标准起草小组。2、查

30、阅食品中沙门氏菌与金黄色葡萄球菌检测技术相关的文献资料。3、对食品中沙门氏菌与金黄色葡萄球菌检验方法引物特异性、准确度、灵敏度等项目进行实验，汇总实验数据，确定实验方案。4、编写标准编制说明和起草标准文本，召集起草小组全体成员讨论通过该地方标准初稿。5、请自治区内的相关专家对标准的初稿进行审定，根据专家提出的意见修改后形成送审稿。二、标准编制原则和标准主要内容的确定二、标准编制原则和标准主要内容的确定本标准的编制遵循有利于食品产业的健康发展，能辅助传统的细菌培养法提高检验结果的可靠性，为生产企业提供准确、快速、可靠、简便的检测方法并为应对食品安全事件提供强有力的技术保障。符合国家的法律、法规和强制性标准规定的原则。本标准编写格式按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规定编写。方法是经过试验条件摸索，方法验证、引物特异性、准确度和灵敏度试验后形成检测方法标准。方法验证过程具体内容详见附件 1。三、采用国际标准或国外先进标准程度有关情况的说明三、采用国际标准或国外先进标准程度有关情况的说明本标准无采用。四、标准性质的建议四、标准性质的建议作为检验方法标准，建议本标准作为推荐性地方标准发布和实施。DB64/T17宁夏回族自治区食品检测研究院标准起草小组2019 年 08 月 28 日