设计引物注意事项.pdf

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1、primer5 和 Oligo 结合设计引物步骤及心得来源： 北京力途科技有限公司 2010-5-21访问量：5979评论(0)分享 1一、引物设计一、引物设计 stepstep byby stepstep1、在 NCBI 上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在 CDS 选项中，找到编码区所在位置，在下面的 origin 中，Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象。2、用 Primer Premier5 搜索引物打开 Primer Premier5，点击 File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接

2、翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击 Search 按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters 里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100200bp 的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300500bp.点击 OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综

3、合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3不要出现连续的 3 个碱基相连的情况，比如GGG 或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在 5570 度之间，GC应该在 4555间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2 度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好

4、。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽， 比如引物存在错配的话， 可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo 来完成，Oligo 自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.在 Primer5 窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏， 选择 File-Print-Current pair，使用 PDF 虚拟打印机， 即可转换为 Pdf 文档，里面有该引物的详细信息。3、用 Oligo 验证评估引物在 Oligo 软件界面，File 菜单下，选择 Open，

5、定位到目的 cDNA 序列（在 primer中，该序列已经被保存为Seq 文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和 Tm 窗口。在Tm 窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5 已经给出）即可，而引物长度可以通过点击ChangeCurrent oligo length 来改变。定位后，点击Tm 窗口的 Upper 按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower 按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用 Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。Analyze 中，第

6、一项为 Key info，点击 Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值 Oligo 是采用 nearest neighbor method 计算，会比Primer5 中引物的 Tm 值略高， 此窗口中还给出引物的Delta G 和 3端的 Delta G.3端的 Delta G 过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA 聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过 9。Analyze 中第二项为 Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择

7、Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR 反应异常的重要因素， 因此应该避免设计的引物存在二聚体， 至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其 Delta G 值应该偏低，一般不要使其超过 4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3 个。Oligo 此项的分析窗口中分别给出了3端和整个引物的二聚体图示和Delta G 值。Analyze 中第三项为 Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G 值不要超过 4.5kcal/mol，碱基对不要超过3 个。Analyze 中第四项为 Compos

8、ition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和 Tm 值。上下游引物的 GC需要控制在 4060，而且上下游引物之间的 GC 不要相差太大。Tm 值共有 3 个，分别采用三种方法计算出来，包括nearestneighbor method、GC method 和 2(AT)4(GC)method，最后一种应该是 Primer5 所采用的方法，Tm值可以控制在 5070 度之间。第五项为 False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5 中虽然也有 False priming 分析，但不如oligo 详细，并且oligo 会给我正确引发效率和

9、错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在 100 以下， 当然有时候正确位点的引发效率很高的话， 比如达到 400500，错误引发效率超过100 幅度若不大的话，也可以接受。Analyze 中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR 反应 Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR 反应的二级结构存在，并且Delta G 值偏大的话，Oligo 在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。引物评价完毕后，可以选择FilePrint，打印为PDF 文件保存，文件中将会包括所

10、有 Oligo 软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm 窗口和 Delta G 窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和 PCR 窗口。4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast 分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast 结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。二、引物设计过程中的心得1、Primer 5.0 搜索引物Primer Length 我常设置在 1830bp,短了特异性不好， 长了没有必要。 当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。PCR

11、 Product size 最好是 100500bp 之间，小于 100bp 的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。Search parameters 还是选 Manual 吧，Search stringency 应选 High，GC 含量一般是 4060。其它参数默认就可以了。搜索出来的引物，按 Rating 排序，逐个送Oligo 软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3 端2 个 A 或 T,或引物内部连续的 G 或 C太多，或引物3 端2 个 G 或 C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，

12、如果其它各项指标还可以， 我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基， 看看引物的评估参数有没有变好点。2、Oligo 6.0 评估引物在 analyze 里， Duplex Formation 不管是上游引物、 下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3 -Dimer 绝对值应小于 4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall 绝对值一般应小于多少kcal/mol 跟 PCR 退火温度有关，我几次实验感觉在PCR 退火温度在65 的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol 没有问题

13、。Hairpin Formation 根据黄金法则False priming sites: Primer 的 priming efficiency 应该是错配地方的 4 倍左右，更多当然更好。在 PCR 栏， 设计者感觉其所显示的optimal annealing temperature 数值值得参考。在 PCR 摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2 的范围就可以了。Internal stability 很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证 3 端不要过于稳定。 下图引物 3 端过于稳定，很容易导致不适当扩增。G 参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里

14、，这滴水就会不停的扩散分布， 扩散的越厉害越稳定，所以G 绝对值越大结构越稳定。3、其他两个评价系统不一样， 丁香园战友感觉 oligo 评价引物好点，primer 出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo 测试。这是初步的选择，其实引物到了 oligo 里，退火温度也不一样。3 端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50 的退火温度肯定和 65 对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在4.5kcal/mol 以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。我们感觉 3 端有 A 无 A 影响不大， 3 端有 T 是不是一定不行， 不见得。 软件是评估，法则也不是没有例外，不是112 那么确定。错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。GC 含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3 端来两个 G 或 C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。