伤寒菌苗制造及检定规程.doc

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1、伤寒菌苗制造及检定规程伤寒菌苗制造及检定规程本品系用伤寒菌培育后取菌苔制成悬液，加甲醛杀菌，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成每 ml 含菌 3 亿制成。用于预防伤寒。1 1 菌种菌种1.1 菌种来源制造伤寒菌苗用的菌种及检定菌种用的诊断血清，应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。1.2 菌种检定定菌种可用 pH7.27.4 的肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜的培养基。1.2.1 培养特性制造菌苗的菌株应具有典型的形态、培养和生化特性。1.2.2 血清凝集试验用 37培育 1820 小时的培养物以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成含菌 6 亿/ml，与伤寒菌诊断血清作定量凝集试验，充分混合后放 37过夜，以肉眼见

2、到凝集（+）之血清最高稀释度为凝集反应之效价。凝集价不应低于血清原效价之半。并用伤寒 Vi 及 O 血清做凝集试验，应与 Vi 血清有凝集，与 O 血清不凝集，或仅有较低凝集。1.2.3 毒力试验用 37培育 1216 小时的琼脂培养物以生理盐水稀释成6 亿/ml、3 亿/ml、1.5 亿/ml 及 0.75 亿/ml 等浓度的菌液（根据菌种毒力情况稀释度可作更改也可增加稀释度）。每 1 稀释度的菌悬液腹腔注射体重 1416g 之小白鼠，最少 5 只，每只0.5ml，观察 3 天。使小白鼠于感染后 3 天内全部死亡的最小剂量为 1 个致死量（LD），1LD 应不超过 1.5 亿菌。1.2.4

3、毒性试验用 37培育 1820 小时之琼脂培养物混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，56加温 1 小时（或其他方法杀菌）。不加防腐剂。杀菌试验合格后稀释为每 ml 含菌 60、30 及 15 亿共 3 个浓度，每个浓度的菌悬液以 0.5ml 腹腔注射体重 1518g 小白鼠5 只，观察 3 天，注射 7.5 亿菌之小白鼠应全部生存，注射 15亿菌之 5 只小白鼠可有 3 只死亡。1.2.5 免疫力试验按伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗制造及检定规程1.2.5项进行。1.2.6 抗原性试验选体重 2kg 左右之健康家兔至少 3 只，用免疫力试验所用之菌液静脉注射 3 次，每次 0.5ml，第 1 次注射 7

4、亿菌，第 2次 14 亿菌，第 3 次 21 亿菌，每次间隔 7 天。末次注射后1014 天采血做定量凝集试验测定效价，2/3 家兔血清之凝集效价不低于 112800 为合格。1.3 菌种保存菌种应冻干保存，冻干菌种保存于 28菌种冻干后应抽取样品按 1.2 项进行检查，合格后可使用3 年，以后每次生产前必须检查全部特性一次，合格者可继续使用 2 年。2 2 菌苗制造菌苗制造制造伤寒菌苗应选用 2 个菌株。2.1 菌种冻干菌种启开后应检查菌形、纯度及玻片凝集试验（包括用 Vi 血清做玻凝集反应），合格后即可使用，每启开 1 支冻干菌种用于生产不应超过 6 代。2.2 制造用培养基用 pH7.2

5、7.4 的马丁琼脂或肉汤琼脂或其他适宜的培养基。2.3 原液制造2.3.1 接种可采用涂种，接种后置 37培育 1824 小时。2.3.2 采集采集前应逐瓶检查，有杂菌者废弃。刮取菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水中。2.3.3 纯菌试验原液采集后应逐瓶取样接种琼脂斜面 1 管，于 37培育 2天，24261 天，如有杂菌生长应废弃。2.3.4 杀菌原液中加入不超过 1.1%0.1%(ml /ml)的甲醛溶液杀菌。加杀菌剂后的原液应放在 37，不得超过 7 天，以后保存于28。2.3.5 无菌试验纯菌试验合格的原液，应取样接种不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基及普通琼脂斜面各 1 管，放 37培育 5 天，

6、如有本菌生长，可加培量复试一次；如有杂菌生长应废弃。2.3.6 原液合并无菌试验合格的原液按不同菌株或不同制造日期分别过滤合并。合并后应加不超过 0.5%（g /ml）苯酚或其他适宜防腐剂，保存于 28。2.4 原液检定2.4.1 镜检菌形应正常，无杂菌。2.4.2 凝集试验原液与相应血清进行凝集试验，其凝集效价不应低于血清原效价之半。2.4.3 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。2.4.4 浓度制定应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。2.4.5 免疫力试验原液于无菌试验合格后与质量检定部门会同进行，抽检批数不应少于生产批数的 1/5。方法同 1.2.5 项，唯所用小白鼠每组至少

7、 15 只，保护 60%免疫小白鼠活存为合格。2.5 原液保存原液应保存于 28。原液自采集之日起至用于菌苗稀释时不得少于 4 个月，保存效期自采集之日起为 2 年半。2.6 菌苗稀释2.6.1 原液配合稀释前应先将不同菌株所制之原液按菌数等量混合，但每个菌株所加的菌数与应加菌数在总菌数不变的原则下允许两个菌株之间在 40%范围内互有增减。2.6.2 菌苗稀释稀释菌苗用含 0.25%0.5%（g /ml）苯酚或其他适宜的防腐剂之磷酸盐缓冲生理盐水。2.6.3 菌苗浓度每 ml 含伤寒菌 3 亿2.7 菌苗分批同组配合的原液用同一批稀释液在同一日稀释的各瓶菌苗为 1 批。大罐稀释的应按大罐分批，

8、并按分装机分为亚批。2.8 检定稀释后每批应逐瓶抽样进行无菌试验及测定防腐剂含量（大罐稀时除外）。2.9 分装分装后每亚批应抽样送质量检定部门进行成品检定。3 3 成品检定成品检定3.1 物理化学检查菌苗应为乳白色悬液，pH 值为 6.87.4，不应有摇不散的菌块及异物。苯酚含量应为 0.25%0.5%（g /ml）。3.2 菌形及纯度染色镜检，应为革兰氏阴性杆菌。至少观察 10 个视野，平均每个视野内不得有 10 个以上非典型菌（线状、粗大或染色可颖杆菌），并不应有杂菌。3.3 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.4 安全试验3.4.1 毒性试验用体重 1820g 之健康小白鼠 5 只，每只腹腔注射菌苗0.5ml，或用体重 350450g 之健康豚鼠 2 只，腹腔注射菌苗1.5ml，观察 7 日，应无死亡。3.4.2 防腐剂试验用体重 1820g 之健康小白鼠 2 只，每只皮下注射菌苗0.5ml，用苯酚作防腐剂的菌苗注射之小白鼠会发生战栗症状，但不应超过半小时，观察 7 日，不得有局部脓肿或死亡。4 4 保存与效期保存与效期应保存于 28。自稀释之日起效期为 1 年半。如原液保存超过 1 年稀释，应相应缩短效期（自原液采集之日起总效期不得超过 2 年半）。