森林脑炎疫苗制造及检定规程.doc

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1、森林脑炎疫苗制造及检定规程森林脑炎疫苗制造及检定规程森林脑炎疫苗系用森林脑炎病毒“森林”株接种于地鼠肾单层细胞，培育后收获病毒液，加入甲醛溶液将病毒灭活后制成。用于预防森林脑炎。1 1 毒种毒种1.1 毒种来源卫生部长春生物制品研究所保存之冻干毒种“森林”株。每 35 年会同中国药品生物制品检定所应用新分离的流行株病毒攻击，检测“森林”株的保护力，以了解该毒株的有效性。1.2 毒种检定1.2.1 无菌试验毒种启封及每次传代后，均需做无菌试验，合格者方可使用。1.2.2 病毒滴定每正代必须用小白鼠进行脑内滴定。滴度9.0LogLD50/1.0ml 方可用于生产。1.2.3 纯毒试验生产前须用小白

2、鼠脑内法做中和试验鉴定毒种的特异性，中和指数必须在 500 以上。生产中如对毒种有怀疑，应及时进行鉴定。1.3 毒种传代分正亚代传递。传递代数正代不得超过 15 代，传代时选用体重 1012g 健康小白鼠或乳鼠。每次毒种传代不得少于 3 个鼠脑。脑内接种病毒，72 小时后选择眼结膜正常，有典型战栗、痉挛、肢体麻痹的小白鼠，处死后无菌取脑，并进行无菌试验。如发现污染者，应及时废弃。1.4 毒种保存鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60以下，无菌试验通过后方可使用。亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成 10%脑悬液，分装小瓶，冻存于-60以下，无菌试验合格后备用。冻干毒种保存在 28。森林脑炎病毒“森林”

3、株属二类毒种，必须设专人按有关规定负责管理，使用前、后记录清楚。2 2 疫苗制造疫苗制造2.1 细胞制备2.1.1 地鼠选用 2 周龄左右的健康地鼠。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。2.1.2 细胞消化及培养处死地鼠，无菌取肾，加入适量胰蛋白酶液消化。用营养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，于 37进行培养。营养液中牛血清含量不得超过 8%。2.1.3 外源因子检查每生产批细胞留 5%（或不少于 500ml）悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞尝试和处理均与生产过程平行进行。至原液收获之日，用显微镜观察，应无病变发生。并用 0.2%0.5%豚鼠红细胞（4保存不超过

4、 7 天）进行血吸附试验，置 4830 分钟判定结果；再置 202530 分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可凝病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。2.2 病毒接种和培育2.2.1 生产毒种配制将鼠脑毒种解冻乳化，制成 10%20%脑悬液，离心，取上清液作为毒种。亦可用冰冻鼠脑毒种悬液感染细胞。2.2.2 病毒接种和培育选择生长良好的细胞瓶，充分喷洗细胞后，加入适量含有病毒的营养液（病毒量不得大于 7.0LogLD50/1.0ml），在适当温度下培育适当时间，弃去病毒培养液，换以新维持液，继续培育一定时间。2.2.3 疫苗生产过程中不得加青霉素或

5、其他 内酰胺类抗生素。2.3 原液2.3.1 病毒灭活选择有典型细胞病变的培养瓶，经肉眼检查无菌者进行澄清过滤，按瓶取无菌试验及病毒滴定样品，取样后立即加甲醛溶液和硫柳汞，使甲醛的最终浓度为 0.05%，硫柳汞为0.005%，置适当温度下灭活。无菌试验为接种琼脂斜面培养基，3 天判定，长菌者废弃。2.3.2 过滤合并及取样单瓶无菌试验未长菌、灭活到期、病毒滴定合格的疫苗进行过滤合并，摇匀后做无菌试验，取安全试验和效力试验样品。安全试验每批合并检定疫苗量不得超过 15 万 ml，效力试验每批合并检定疫苗量不得超过 100 万 ml。检定批号和成品批号应一致。2.3.3 原液检定2.3.3.1 无

6、菌试验按生物制品无菌试验规程进行。2.3.3.2 病毒滴定将滴定样品做 10 倍系列稀释，取至少 3 个稀释度，每个稀释度病毒液脑内接种体重 79g 小白鼠 4 只，每只 0.03ml，逐日观察，14 天判定结果（3 天内非特异性死亡者不计，）滴度7.0LogLD50/1.0ml 判为合格。不合格者可重试一次。每个滴定批代表疫苗量不得超过 15 万 ml。2.4 半成品检定2.4.1 灭活试验（1）动物法：将样品脑内接种体重 1214g 小白鼠 8 只，每只 0.03ml，同时腹腔接种 0.5ml，为第一代；7 天后将第一代小白鼠处死 3 只，取脑做成 10%悬液，脑内接种 6 只小白鼠，为第

7、二代；7 天后将第二代小白鼠处死 3 只，同法接种 6 只小白鼠，为第三代。每代小白鼠从接种之日起逐日观察 14 天，在观察过程中全部健存为合格，接种后 3 日内非特异性死亡者不计。若传代 3 日后有个别小白鼠死亡，应立即取死鼠脑乳化成悬液再接种 3 只小白鼠，观察 14 天，该 3 只小白鼠健存仍判为合格。如仍有小白鼠死亡，该批疫苗应重试，重试合格后仍可使用。若传出活病毒应重试，查明原因。必要时继续灭活并进行灭活试验，若仍传出活病毒，该批半成品应予废弃。（2）细胞培养-动物法：将样品 50ml 装入透析袋内，放入60008000ml 维持液中于 4透析 24 小时，接种地鼠肾细胞或BHK21

8、 细胞，每 ml 样品接种不少于 3cm2的细胞片，置培养病毒的温度下培育 14 天，全部健存判为合格。若有死亡者应查明原因或重试，重试合格者仍可使用，不合格者应废弃。以上两种灭活试验方法可任选一种。2.4.2 残余牛血清蛋白含量测定用检定所认可的试剂和方法测定，残余牛血清蛋白含量应50ng/ml。2.4.3 效力试验每批疫苗腹腔免疫体重 1012g 小白鼠 35 只，于第1、3、5 日共免疫 3 次，每次每只小白鼠 0.3ml。另取同批小白鼠 35 只作为空白对照。于第 10 日以“森林”毒种 0.3ml 进行腹腔攻击，每天观察 1 次，观察 21 天判定结果。对照组LogLD50/0.3m

9、l 在 7.5 以上，免疫保护指数达 100000 以上为合格。不合格者可重试 1 次。3 3 成品检定成品检定3.1 物理检查疫苗应为橘红色透明液体，无异物。3.2 化学检查按生物制品化学检定规程进行。pH 值为 7.28.0。游离甲醛不高于 0.05%，硫柳汞不高于 0.01%。3.3 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.4 安全试验每批疫苗腹腔注射体重 1820g 小白鼠 4 只，每只0.5ml，逐日观察，3 日内全部健存判为合格。如有小白鼠死亡，除检查原因外，应立即进行重试。3.5 亚硫酸氢钠检定分装后亚硫酸氢钠要进行含量测定和无毒性试验。含量不得低于原配浓度的 60%。无毒性试验系将样品稀释成 1100，腹腔注射体重 1820g 小白鼠 2 只，每只 0.5ml，观察 5 日，应全部健存。4 4 保存与效期保存与效期保存于 28暗处。自效力检定合格之日起效期为 2 年。