人二倍体细胞建株检定及制备疫苗规程.doc

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1、人二倍体细胞建株检定及制备疫苗规程人二倍体细胞建株检定及制备疫苗规程人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。BA 细胞株的要求/B用于疫苗生产的人二倍体细胞株（以下简称细胞株）须按下列规定进行全面检定。新建立细胞株，应按新生物制品审批办法进行审批。1 建立细胞株必须具备下列资料1.1 建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，中止妊娠原因。1.2 建立细胞株所用胎儿的父、母年龄、职业及健康状况，胎儿父、母系三代应无明显遗传缺陷和肿瘤疾病历史。在取胎儿组织时，应作出详细调查，报卫生部审批前，应进行一次重复调查。1.3 原始组织种类，原代培养的数量与生长状况。1.4 细胞培养史和生

2、长特征，细胞寿命、世代数。1.5 细胞生长液的成分。2 细胞株的检定2.1 染色体的鉴定和制片细胞原系建株过程，每 812 世代*应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有 45 次染色体检查结果。每次染色体检查，应从同一世代不同细胞培养瓶中取细胞混合再培养，制备染色体标本片。染色体标本应长期保存（直至褪色不能用为止），以备复查。每次染色体检查，至少应随机取 1000 个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并作出有助于复查的记录，其中至少选择 50 个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析。并应粗数 500 个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。可以 G 分带或

3、Q 分带技术检查 50 个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。以显带技术检出的核型异常（假二倍体、倒位、易位等）发生率应用比现用上限更宽的基本数据进行评价，合格上限尚未定出。2.1.1 合格要求1000 个和 500 个中医细胞标本中，检查异常率、合格的上限（可信限 95%，Poison 法）如表 1。表 1检查细胞数（个） 异常 1000500100染色单体和染色体断裂47268结构异常17102超二培性852亚二倍性*1809018多倍性*30174*亚二倍性超过上限时，可选用批标本片重数*+一个中期细胞内超过 53 条染色体即为一个多倍体2.1.2 染色体制片要求应及时进行制片

4、质量检查，如发现细胞堆积，染色体分散不好等，由于技术原因不适于读片时，可以及时重新制片。但已经读片后，不断因某项超过标准（亚二位性除外）而废弃不算。如考虑到制片技术与质量问题，可重试两次，当有一次结果与原结果相近时，又无可知原因，应以原结果为准。2.2 外源因子检查细胞株不应有细菌、霉菌、支原体和病毒等污染。每812 世代细胞培养物，应进行下列检查。2.2.1 细菌、霉菌、支原体检查按生物制品无菌试验规程进行。2.2.2 病毒检查2.2.2.1 细胞直接观察及红细胞吸附试验取混合瓶细胞样品，接种小瓶或小管，长成单层后更换维持液，观察 2 周，镜检细胞，应保持正常形态特征。培养 7 天，用 0.

5、2%0.5%鸡和豚鼠混合红细胞悬液进行红细胞吸附试验，先置于 48，后置于 2025，各 30 分钟，两次观察结果均应为阴性。2.2.2.2 细胞培养检查细胞培养的上清液混合样品，至少接种 4 种细胞（原代人肾或猴肾细胞、原代兔肾细胞、人源传代细胞和另一批人二倍体细胞）。接种的样品量应占维持液的 20%以上，于培养 57天和 14 天时，进行红细胞吸附试验（见 2.2.2.1 项）。培养 7天的上清液在同种细胞培养上盲传一代，观察 14 天，应无细胞病变，红细胞吸附试验应为阴性（在该试验的细胞维持液中，允许加入少量该细胞培养用的牛血清，以利细胞维持和观察）。2.2.2.3 动物试验检查用乳鼠、

6、成鼠、家兔、豚鼠和鸡胚各一组。每组动物或鸡胚接种受检细胞不应少于 107。按表 2 所列要求进行试验和观察。如 80%以上动物和鸡胚健存，此试验为通过。2.2.2.4 其他检查细胞株传代过程中，至少于 2 个不同世代水平进行包涵体、乙型肝炎表面抗原及电镜检查，结果均应为阴性。2.3 肿瘤原体检查每 812 世代做一次细胞株的异种移植试验，观察细胞株有无致肿瘤性质，每次实验使用 6 只乳鼠（35 日龄）或体重810g 小白鼠，经抗胸腺血清（ATS）处理，皮下接种活二倍体细胞（最适传代的细胞），观察 14 天，检查有无结节形成。有结节或可疑病灶时，做病理切片检查。试验同时，用 HeLa 或其他人源

7、传代细胞系做阳性对照试验，用动物数与处理方法同试验组，接种被检二倍体细胞数应为对照肿瘤细胞数的 5 倍以上。结果二倍体细胞株不应有移植瘤形成，而对照组细胞则应有 80%或更多的动物有典型移植瘤出现（肿瘤结节需经病理组织学诊断）。表 2动物组别要求动物或鸡胚数接种途径接种细胞悬液量（ml/只）观察天数结果乳鼠24小时内2 窝10脑内腹腔0.010.121应健存成鼠1214g10脑内腹腔0.030.521应健存豚鼠350500g5腹腔5.042应健存,解剖无结核病变家兔1.52.5kg5皮内皮下0.110*9.021无异常健存鸡胚911 日龄10尿囊腔0.234尿液血凝试验阴性*豚鼠于注射前及观察

8、 4 周作旧结核菌素试验，应为阴性*每只于背部皮内注射 10 处，每处 0.1ml*应用豚鼠和鸡混合红细胞作直接血凝试验可以用任何以免疫抑制剂处理，并对肿瘤细胞有同样敏感性的其他动物试验，如无胸腺小白鼠（nude nu/nu 基因型等）。3 细胞种子细胞株传代过程的早期，应选定适应世代数培养出大量细胞，制成悬液，分装安瓿作为细胞种子。置液氮中冻存，以备细胞株建成后，大量供应细胞。冻存的种子细胞活存率应在 60%以上。冻存后一定时间，应至少复苏培养一系至衰老期，并在不同传代水平，检查细胞株的生长、胞核学特征、异种移植等，证明细胞经冻存后的生物学性质无明显改变。BB 二倍体细胞用于疫苗生产的要求/

9、B1 细胞1.1 细胞株用于疫苗生产的细胞株，必须符合本规程要求。不含外源因子、核型正常、对病毒敏感和具有足够多的细胞种子。可用KMB-17、2BS 等细胞株。所用细胞株均须经卫生部批准。1.2 细胞种子批一个细胞种子批应有足够量早世代细胞，分装安瓿保存于液氮中，作为细胞种子。2 生产用细胞种子批用一个或数个细胞种子安瓿传代增殖到适宜世代，具有一定量的均一细胞悬液，分装安瓿，标明世代、安瓿号和冻存的日期，保存于液氮中，作为生产用细胞种子。2.1 生产用细胞种子批检定2.1.1 细菌、霉菌、支原体检查按生物制品无菌试验规程进行。2.1.2 动物和鸡胚检查外源因子用生产用细胞种子世代水平或至 2/

10、3 世代寿命水平的细胞作检定样品。用下列动物和鸡胚检查：乳鼠（242 窝1小时内）最少0 只成鼠1214g10 只豚鼠350500g5只家兔1.52.5kg5只鸡胚911 日龄10 只各种动物和鸡胚的接种法、观察期，按照 A2.2.2.3 条进行。2.1.3 肿瘤原性检查按 A2.3 项执行。2.1.4 染色体的监测检查用于生产的最后一个世代或其后任一世代，至少检查500 个中期细胞的多倍性、染色体精确计数、断裂率、结构异常及其他异常发生率，例如螺旋消失或初级次缢痕或次级次缢痕的明显减弱等。按 A2.1.1 项进行评价。生产用细胞库细胞染色体监测用的染色体标本片和照片，应作为该细胞批监测此细胞

11、生产疫苗批的记录，永久保存。3 生产用细胞的培养3.1 从生产用细胞种子开始传代培养，以适宜分种率连续传代，直至增殖足够量的细胞培养物用于生产。用于生产的细胞世代，应在细胞整个寿命期的前 2/3 世代内。3.2 细胞外源因子检查于种毒当天，或在连续传代种毒，于最后一次细胞种毒当天，此批细胞留取 2%5%不种毒，换维持液作为正常细胞对照，以检查外源因子。从换液之日起观察 2 周，细胞应无异常变化。用换维持液 02 天的对照细胞上清液，接种原代兔肾、非人灵长类传代细胞及另一批人二倍体细胞，接种样品量应占维持液的 20%。观察 14 天，换液后 58 天用上清液，在相应细胞盲代一代，观察 14 天，

12、做血吸附试验。在收毒时，用 0.2%0.5%鸡和豚鼠红细胞，在 28和2025做血吸附试验，应为阴性。3.3 细胞鉴别试验在生产用细胞世代水平或其后数代，检查 300 个中期细胞，计数多倍体，作 100 个中期细胞染色体检查，应核型正常，鉴别确为本细胞无误。除染色体监测外，还可用 HLA 表面抗原鉴定试验。*细胞“世代”的说明：英文是“Population doubling”，简写“PD”，译成“群体培增”，为通俗和习惯以名词“世代”来表示。PD 可按实际计数，增加一倍，或按细胞培养面积，增加一倍，为一个 PD，即一个世代。也就是细胞以 1:2 分种率传代则为一个世纪，以 1:4 分种率传代则为 2 个世代，1:8 分种率传代则为 3 个世代。