蛋白质免疫印记技术实验报告.pdf

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1、实验二蛋白质免疫印迹技术河北大学生命科学学院 2010 生物技术河北保定071002摘要： 目的： 学习掌握动物抗血清的制备原理及技术， 通过实际操作学会动物抗血清的制备，掌握 Westernblotting 的基本原理，熟悉 Westernblotting 的实验操作 。方法： ，使用鸡卵类粘蛋白对小白鼠进行常规免疫，获得抗血清 ，然后利用Westernblotting 检测抗血清 。结果：纯化的鸡卵类粘蛋白能引起小鼠的免疫反应.关键词：常规免疫 抗血清免疫印记Abstract：objective：learn to master the theory andtechnology of pre

2、paring animalsantiserumby operating the experiment in person ,learn to prepare the animals antiserum ,mastering the basic principles of Westernblotting, and beingfamiliar with theexperiment operation of Westernblotting. Methods : using chicken ovomucoid operating theroutine immunization of , and obt

3、ain the antiserum, then detecting the antiserumthrough Westernblotting.Result:Purified chicken ovomucoid can leadtothe laboratory rats immunoreactionKeywords:routine immunizationantiserumWesternblotting前言免疫印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术， 是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂

4、样品中的某种蛋白的方法。 进行免疫之前必须具备可特异性识别目的蛋白质的单抗或多抗，以及含有目的蛋白质的粗制或纯化的样品。 因此，免疫印迹可以从复杂抗原中检出特定的抗原或者从多克隆抗体中检出单克隆抗体， 又可以对转移到固相膜上的抗原或抗体进行连续分析，以取得目的蛋白的定位、定性或定量。现在，免疫印记技术，在对人的病理研究上，也有了很大的应用，免疫印记法检测细胞中癌基因的表达及其意义。1 （潘静坤.免疫印记法检测宫颈液基细胞中 HPV16、18 E6 癌基因的表达及其意义D.中国医科大学,2006.）1、 试剂与器材11 小鼠的常规免疫与抗血清的制备所需试剂与器材注射器蜗旋混合器 纯化的鸡卵类粘蛋

5、白苦味酸（以 75%乙醇配置）标记小鼠佐剂（完全佐剂 不完全佐剂）酒精棉球冰箱离心机1.2 Western Blot12%分离胶，3.6%浓缩胶马斯亮蓝脱色液PVDF 膜甲醇 电泳缓冲液封闭液（0.5%BSA、TBST 溶液）一抗（自制多克隆抗血清以TBST 按 1:100 比例稀释）二抗（羊抗鼠，按1:1000 比例 用 TBST 稀释）DAB 显色液蒸馏水 镊子烧杯海绵垫2 方法2.1 小鼠的常规免疫和抗血清的制备（1）抗原的提取与制备1）抗原为纯化的鸡卵类粘蛋白2）利用苦味酸（以 75%乙醇配置）标记小鼠背部（2）初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠1）抗原与佐剂的混合：取

6、 1.5mL 蛋白与 1.5mL 完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态2）用酒精棉球消毒待注射部位13）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进行加强免疫（3）加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠1）抗原与佐剂的混合：取 1.5mL 蛋白与 1.5mL 不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。2）用酒精棉球消毒待注射部位3 ）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。（4）第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。（5）收集抗血清（第二次加强免疫后一周后）小鼠取血。收集的血液置于室温下 1h 左右，凝固后，置 4下，析出

7、血清，离心，3000rpm,10min。吸出血清，分装（0.050.2mL） ，贮于-20以下冰箱保存。2.2 Western blotting检测抗血清1.抗原 SDS-PAGE凝胶的制备：12%分离胶，3.6%浓缩胶抗原样品的制备：蛋白样品与样品液混合等体积混合后沸水浴5 分钟。点样：2130230330425520630730830925102013 粗品45 抗原（纯品）电泳：浓缩胶（120V）分离胶，170V2.抗原样品经 SDS-PAGE电泳后，取出凝胶，去掉浓缩胶和溴酚兰。从5、6 号点样孔处将胶切开，并全切下胶的右下角作为标记，有1-5 号孔的胶浸在转移电泳液中用于转移电泳；6

8、-10 号孔的胶放到考马斯亮蓝中染色15 分钟，加脱色液脱色。3.转移电泳（1）戴上手套，剪一块与胶同样大小（？cm？cm）的 PVDF 膜，甲醇活化 15 秒，然后浸泡在转移电泳缓冲液中1530min 待用。（2）将海绵垫浸泡在转移电泳缓冲液中，避免产生气泡。（3）打开转移电泳槽的塑料夹板，负极板在下，首先放上两层海绵泡沫板，再铺上用电泳液浸泡过的 36 层滤纸，依次加上凝胶、膜、36 层滤纸、两层海绵泡沫板、正极板，各层接触后均用玻璃棒赶出之间的气泡。（4）插入电泳槽内（注意凝胶一边在负极端） ，加转移电泳液，4冰箱中稳流 15mA 进行转移电泳 1h。（5）取出膜，用冷风吹至半干，放入冰

9、箱保存。4.封闭将膜放入封闭液（0.5%BSA、TBST 溶液）中，37脱色摇床振荡反应 1h。TBST 振荡洗膜三次，每次用 TBST 50mL，每次 5min。5.与一抗、二抗结合（1）一抗，3 毫升：自制多克隆抗血清以TBST 按 1:100 比例稀释，即取 30 微升一抗，再加入 3mLTBST。（2）将膜转移至一抗（稀释好的自制抗血清）中，37振荡反应 1h 或室温反应 2h 以上。（3）于 TBST 中洗膜三次，每次 5min。(4)加入二抗（羊抗鼠，按1:1000 比例 用 TBST 稀释） ，37反应 1h 或室温反应 2h 以上。(5)TBST 洗膜三次，每次 5min。6.显色(1)取 10-15mL DAB显色液置于平皿中。(2)将膜放入显色液中，脱色摇床上震荡直至出现条带，用大量清水冲洗以终止反应。(3)冷风吹干，扫描杂交结果。3结果3