核酸的提取经验及原理总结.pdf

《核酸的提取经验及原理总结.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸的提取经验及原理总结.pdf（9页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、一、一、核酸核酸核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸， 因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。 今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。 一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。 核酸是1869 年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于 1889 年认识其酸性后，定名为核酸。二、二、核酸的分类和功能核酸的分类和功能核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。DNA 贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子

2、细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的 DNA；RNA 主要在蛋白质合成中起作用，负责将 DNA 的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3 种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA 和 RNA 中的戊糖不同，RNA 中的戊糖是 D-核糖； DNA 不含核糖而含 D-2-脱氧核糖(核糖中 2 位碳原子上的羟基为氢所取代)。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA 和 RNA 的碱基也有所不同。三、三、核酸的理化性质核酸的理化性质RNA 和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶， DNA 则为白色类似石棉样的纤维状物。 除肌苷酸、鸟

3、苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA 和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA 钠盐在水中溶解度可达 40g/L，DNA 钠盐在水中为 10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA 易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的 DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取 DNA 时，先把 DNP 抽提出来，再把 P 除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离 DNA 。四、四、细胞裂解：细胞裂解：（一）裂解原理在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。经典的裂解

4、液几乎都含有去污剂 (如 SDS、 Triton X-100、 NP-40、 Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、 EDTA、 NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质， 从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂(如 GIT、Gu

5、HCl 等) 裂解的，该方法已经成为了RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。（二） 细胞的裂解方法细菌细胞破碎方法有以下几种：1）机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法。关于超声波处理法，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5 秒，间隙时间最好大于超声时间。2）化学试剂法：用含 SDS 或 CTAB的溶液处理细胞，在一定的 p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相， p H 环境则由加入的强碱 (NaOH) 或缓冲液( TE、STE 等) 提供，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA 等

6、) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。3）反复冻融法：将细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。个人经验一般情况，37,3min，液氮 3min,反复三次即可以。4）酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶、蛋白酶K 等，都可使细胞壁破碎，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和 N-乙酰胞壁酸残基间的 -(1 ,4) 键水解。蛋白酶 K 能催化水解多种多肽键,其在 65 及有 EDTA、 尿素(14

7、mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。 具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、 待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。（三）裂解方法的评价含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住

8、，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质 “缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除， 导致 DNA 的损失。 当然去污剂裂解方法， 仍然在细胞基因组 DNA抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高， 而经济性及操作简单很重要时。 控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。 该方法结合高盐沉淀， 可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。高

9、浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、 GuHCl 等) 的裂解方法， 是抽提 RNA 的首选。 总 RNA的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质 “缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。 当然有些样品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质

10、) ，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。(即，蛋白质含量过高的样品抽提 RNA也要用蛋白酶)该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是 CTAB 的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号不同，效果就可能差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时， CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。 裂解时的温

11、度， 多使用 65C； 但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下 37C 45C 这个相对低温的区域。SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法， 具有快速、 得率高、 几乎无基因组 DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4 静置一段时间以及采用 4 离心去蛋白质，都可以提高质量。该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/m

12、l) 来实现。总的感觉是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的残留少一些。 不过， 经典沉淀几乎没有办法彻底去除 RNA 残留。 另外， 对大质粒 (50 kb 以上)，该方法可能会有问题。PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性 (即没有扩增出来的阳性) 比例也比较高。该方法最简单的就是反复冻融法，简便快捷，不需任何化学试剂，冻融离心，PCR 检测就可以了。如果使用裂解法，哪么最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效

13、率， 甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品， 但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。 降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。裂解液的用量原则是裂解液的用量原则是： 确保能彻底裂解样品， 同时使裂解体系中核酸的浓度适中。 浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且

14、不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的， 而不是以核酸含量为基准， 这一点务必牢记。五、五、核酸纯化核酸纯化就个人所知，目前在科研领域广泛使用的核酸纯化技术主要可以分为两大类： 使用介质的和不使用介质的，使用介质的，一次就将核酸与其它所有杂质分开；不使用介质的，一定是首先将核酸和盐与大分子杂质分开，再通过沉淀核酸使核酸与盐分开(PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。1）经典的使用苯酚/氯仿抽提的纯化技术：细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1 体积) 混合液。 依据应用目的， 两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单

15、颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸)后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂，预先要用 STE 缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联；故在制备酚饱和液时要加入一特殊物质，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 05.5 ，终浓度为 0.3M 的 Na

16、Ac 或 KAc 后，钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷，在酸性环境中促进核酸的疏水复性。 然后加入 22. 5 倍体积的乙醇,经一定时间的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂（ 异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等）和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。2）使用离子交换介质的纯化技术：将裂解液过柱，核酸被联结在离子交换介质上；洗涤去除残留的杂质后，用高盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来。再经过标准的乙醇/异丙醇沉淀、 乙醇洗涤、 干燥等操作， 获得纯的核酸， 溶解于合适的缓冲液中。3） 使用吸附介质的纯化技术：将

17、裂解液过柱，核酸被吸附介质选择性吸附；洗涤去除残留的杂质后， 用水或者合适的低盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来， 就可以直接用于后续实验。4) 密度梯度离心法：密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链 DNA、单链DNA、 RNA 和蛋白质具有不同的密度， 因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备， 其中氯化铯 2 溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒 DNA 的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质 ,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合， 离心后形成的核酸区带经紫外灯照射， 产生荧光而被检测， 用注射针头穿刺回收后， 通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获

18、得纯化的核酸。（二） 纯化方法评价PC(P 是英文酚的缩写，C 是英文氯仿的缩写)抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC 抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)， 该方法完全可以获得高质量的核酸。 虽然每次 PC 抽提都会损失一部分核酸 (因为不可能将水相全部移取)，以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。 该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。PC 抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚 /水相之间。PC 抽提的

19、关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。 许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会部分打断大分子的基因组 DNA，但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀 此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因

20、为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。 超过了该饱和度， 裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。4C 离心操作有利于更彻底去除蛋白质。 PC 抽提的另外一个用途是， 利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点，在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用 PC 抽提的，否则核酸必定降解。高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比， 除了纯度的稳定性可能要低

21、一点外， 该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度(蛋白质残留) 不够稳定。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些。介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。 其最大特点是非常适合大规模核酸抽提， 并且因为受人为操作因素影响小， 纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里； 另外一类则是颗粒状 (如 Glassmilk、 磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可

22、获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中， 与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力 (不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留)。不过，介质纯化方法的成本是最高的。（三）醇的沉淀1）沉淀的原理目的：目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质主要是盐的分离。就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。 实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后， 即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来；或者含有盐

23、，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来 (当然，得率可能会降低)。知道这一点的意义在于： 不要迷信标准方法的唯一性；相反，当使用标准方法碰到问题 主要是纯度问题时，完全可以通过调整沉淀条件来改善。最有参考价值的是的一个沉淀方案： 一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度。2) 沉淀剂的选择： 醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我们并没有发现这二者对质量有大的影响。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜

24、色比较白。这是现象，少量核酸用异丙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀。至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我们没有碰到过，我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。 当然，也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小，可以使绝大部分的小量抽提操作在 1.5ml 离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑， 洗涤时其中心部分不容易被洗涤到， 所以， 洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：一定要使沉淀悬浮起来， 一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。 如果再洗涤一次，质量决不会有问题的。当然，沉淀所用的试剂，不仅仅就乙醇和异丙醇，还有包括 PEG、 LiCl、 CTAB 都可以用于核酸沉淀， 虽然它们远没有醇沉淀的高使用

25、频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。3) 沉淀温度的选择：如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。（四）核酸的洗涤1）洗涤原理与目的： 洗涤对于整个提取过程来说，也是非常重要的。洗涤，首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要控制一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松)；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。大部分资料中的操作基本上都是“倒

26、掉上清后倒置在吸水纸上片刻”，这一说法，对于质量好的离心管，如果离心管是经过硅化的，因为液体几乎不挂壁，所以上清可以去除得非常彻底；好的管子，即使没有经过硅化，残留量也非常少，也没有什么问题；差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验。避免液体残余的一个好方法，就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。还有需大家牢记的是，残液中都含有上一步操作中的杂质，其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇， 杂质是不会被挥发去除的。 这步， 切忌用手甩， 这样容易将核酸甩掉。 另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度。 沉淀越大，裂解液的裂解能力越强

27、，洗涤越要彻底：放置时间相对要长一点，洗涤次数也要考虑增加。当然，乙醇浓度的选择也非常重要，一般情况，洗涤一定要用室温的 75% 乙醇。（五）核酸的溶解和保存1） 核酸溶解： 纯化后的核酸， 其中 RNA 以水溶解为主， DNA 则多以弱碱性的 Tris或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，其中原因是有人认为EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险； 如果操作过程控制得当，DNase 的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解DNA。2）核酸保存：基本上，核酸在保存中的稳定性， 与温度成反比， 与

28、浓度成正比。一般的我们选择，-20 或 70 保存的稳定。如果温度不合适，保存中核酸发生降解或者消失， 首要原因是酶残留导致的酶解， 第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解 (RNA 在弱酸性更稳定，而 DNA 在弱碱性更合适)。还有一个不为人重视的，就是 EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点，那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应，达到某种均衡。EP 管的材质，首先可能吸附核酸，其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化，如变性。在核酸的浓度比较高时，这个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了。在低浓度的核酸中加入Geletin,Glycogen,BSA 可以稳

29、定核酸，虽然已经为实验所证明，但许多实验人员并没有将该建议当回事。 现在制造 EP 管的材料远多于过去。 这些新出现的材料， 在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP 材质要好许多， 但其化学特征， 尤其是对核酸稳定性的可能影响， 远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样，其负面产物可能是，抽提的质粒电泳的构型越来越多：除了原来的三种带型外，还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。（六）核酸的浓缩应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。 在中等浓度单价阳离子存在下， 加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回

30、收，甚至对低至pg 量的 DNA 或 RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。核酸浓缩的具体操作时，可向含样品的小离心管中加入 V/10 单价阳离子盐贮存液 2V 无水乙醇，混匀，放冰水浴中 1530min，取出目测平衡，04 度，12000g，离心 10min。吸弃上清，再另 70%乙醇 0.51ml，12000g，04 度洗涤离心 2min。吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP 的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用

31、较高浓度的乙醇沉淀 RNA 时， 常用 LiCl， 因 LiCl 在乙醇中溶解度很高， 不随核酸共沉淀。含有 SDS 的核酸样品，应使用 NaCl，这时该去垢剂要 70%乙醇中仍保持可溶。DNA和 RNA 沉淀，大多使用醋酸钠（pH5.2 ） 。六六、核酸质量的检测问题核酸质量的检测问题将抽提好的核酸直接用于后续的实验， 是唯一可靠的检测方法； 除此之外的检测方法，都是相对的，而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围)， 该方法还是非常可信的； 电泳还可以用于估计核酸的

32、浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏度又非常高，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行紫外和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。关于紫外分光光度仪的检测。首先，不要使用不能选择波长的仪器；使用那些已经固定了波长的仪器，大概可以算是你梦魇的开始 (没有信息是可怕的，更可怕的是将错误的信息当真，其中280、320、230、2

33、60nm 下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度） 、盐浓度和蛋白等有机物的值。) 。其次，一定要经常调较仪器；最后，要记住读数 A230 ：A260 ：A280 = 1：2 (DNA 为 1.8) ：1 为理论上的数据，实际测定时会有一些差别；但如果差别太大，就有问题了，有两个值得商榷的观点：如果A260/A230 2 就是纯的，如果 A260/A280 2 就是核酸降解。A260/A230 如果比2.0 大许多，一定是有杂质残留的 (具体是什么杂质我不知道)。如果核酸抽提好后立即就测定， A260/A280 2.0 决不提示核酸降解， 原因是： 那些能导致 A260/A280 2.0的

34、核酸片段非常小，常规的沉淀是不可能将它们沉淀下来的；更可能的原因是：你仪器提供的 A260/A280 实际是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。 纯的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰顶，在 A280 则正好是半山坡。根据曲线在底和顶的斜率最小，在半山坡的斜率最大的特点，不难得出如下结论： A230 和 A260 的读数受仪器准确性的影响比较小，而 A280 受仪器准确性的影响比较大。关于电泳检测，观察琼脂凝胶中DNA 的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA 的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切

35、接近，导致染料与DNA 结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA 吸收 254nm 处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在 302nm 和 366nm 有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的 590nm 处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的 DNA。建议先电泳检测，再用紫外分光光度仪检测。电泳后，可以看到哪些样品根本就不能用 (如降解太厉害)， 以及核酸的大致浓度， 这样就为紫外分光光度仪的检测提供了一个参考 (降解的不必要测了，要测的该取多少量等)。七、核酸中杂质的去除七、核酸中杂质的去除对于一些对核酸纯度要求较高的实

36、验， 我们就需要对其进行特殊的处理， 除去其中的多糖、蛋白质及非目的核酸，其方法如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。除去的方法常有：取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。在浓磷酸盐存在下，以 2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。以钙盐沉淀 DNA，再以草酸钾处理，使之形成 DNA 钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，

37、不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。常用方法有下列几种：加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。 去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用， 效果更加理想。氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下， DNA 或 RNA 都可以进入水相， 蛋白质则沉淀于酚层， 然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀 RNA 或 DNA， 残余的酚可用葡聚糖凝胶 G-10 或 G-25 除去。（3）

38、不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中， DNA 制品中混杂着少量RNA 或 RNA 制品中混杂着少量 DNA 是经常发生的。 由于 DNA 和 RNA 结构和性质都很相似，而且分子量都十分大， 所以两类核酸的分离是核酸纯化工作中比较复杂和繁琐的一步。从 DNA 中除去 RNA 的方法常有：核糖核酸酸酶选择地破坏 RNA，这是比较有效的方法， 但使用的核糖核酸酶中常含有极微量的脱氧核糖核酸酶， 必须事先加热处理除去，然后将纯净的核糖核酸酶与样品溶液一起在 37孵育数分钟，就可达到破坏 RNA 的目的。钙盐分步沉淀：在核酸溶液中加入 1/10 体积 10%的氯化钙溶液，使 DNA 与 RN

39、A 均成为钙盐后，再利用 DNA 钙盐在 2/10 体积乙醇中能形成沉淀析出，RNA 钙盐不形成沉淀而彼此分离。活性炭吸附：将处理好的活性炭按 1/151/20 体积加入每毫升含有 0。 51mgDNA 溶液中， 04。 C 下搅拌 1h ，以 31000g 离心 1h，除去 RNA 后的 DNA 回收率可达 94%。在 RNA 制品中除去 DNA，苯酚水溶液抽提是较有效和常用的方法。 在没有阴离子化合物存在下， 以等体积90%苯酚水溶液反复抽提RNA， 可以除去绝大部分DNA。此外，也可采用加入脱氧核糖核酸酶处理，破坏DNA，或参考上述 DNA 与 RNA 分离方法将 DNA 除去。（4）同

40、类核酸的分离 ：RNA 混合物的分离：经过提取的初步纯化的 RNA制品中含有各类 RNA 和某些已降解的 RNA 混杂物。 进一步纯化时， 多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。 例如 tRNA 与 rRNA 的分离用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后，以不同梯度氯化钠溶液洗脱，或用蔗糖梯度（顶部 5%浓度，底部 20%浓度）离心法分开。 mRNA 的代谢速度较快，在细菌中平均寿命为90min，在哺乳动物中约为几小时至十几小时，常用密度梯度离心法和 DNA-琼脂柱进行分离。制备 rRNA 时，由于共沉作用，常混有mRNA，一般可用萘-1，5-二磺酸处理，使二者分开。各种 tRNA 的提纯，通常采用逆流分溶法在磷酸缓冲液-甲酰胺-异丙醇系统下进行，分离效果较好。 DNA 混合物的分离：主要是变性或降解的DNA 和天然的分离，常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析，逆流分溶， 梯度离心等方法。 一个具有生物活性高度提纯的DNA 制品应具有如下标准：不含有蛋白质及多糖； 不含有可透析的小分子杂物； 在pH7时紫外吸收最大值在257261m之间，E（P）在6600 左右；不含有RNA；固体为纤维状，水溶液具有高的粘度并有流动双折射作用；具有电泳均一性及超离心中单分散性；具有生物活性。