微生物实验方案08.pdf

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1、污泥中的细菌数量和抗 Cu的细菌分离纯化及其菌落形态观察学院：资源环境学院专业：环境工程 1 班组长：罗毅丹201330470117组员：黄冠杰201330470108黎宁201330470110黄于娴201330470109杜彦滔滔 201330470106二 0 一五年三月一、一、实验目的：实验目的：1. 了解配制微生物培养基的基本原理，掌握常规的配制、分装培养基的方法。2. 从环境中分离、培养微生物，掌握一些常用的分离和纯化微生物的方法。3. 学习平板菌落计数的基本原理和方法。4. 学会接种技术。5. 观察分离出来的细菌的个体形态以及其相应的菌落形态特征。6. 通过革兰氏染色进一步巩固染

2、色技术。7. 学习如何分离和纯化抗Cu 细菌，以及观察 Cu 对细菌生长的影响。二、二、实验原理：实验原理：1、培养基的配制培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同， 加之实验和研究的目的不同， 所以培养基的种类很多， 使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、 无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH 值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。抗 Cu 选择性培养基除了一般细菌所需的成分外，还含有铜离子母液，目的在于抑制抗Cu细菌，以利于分离和鉴别抗铜离子细菌生长。

3、 2、灭菌原理本次实验采取干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法。干热灭菌法原理：培养皿、移液管以及其他玻璃器皿可用此法。 利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。 细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时， 当环境和细胞内含水量越大， 则蛋白质凝固就越快， 反之含水量越少， 凝固缓慢。因此，干热灭菌所需温度要高（160170），时间要长（12h），但温度不能超过170，否则包器皿的纸或棉塞会烧焦，甚至引起燃烧。加压蒸汽灭菌法原理： 将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅， 通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。 待蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽， 然后关闭排气阀

4、，继续加热，此时，由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而是沸点增高，得到高于 100 摄氏度的温度， 导致菌体蛋白质变性而达到灭菌的目的。 微生物实验所需的一切器皿、器具、培养基（不耐高温者除外）等都可用此法灭菌。3、分离纯化原理：平板表面涂布法：把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法，通过三角刮刀将菌液分散在培养基表面， 经培养后获得单菌落。 此法加样量不宜太多，只能在 0.5ml(一般为 0.2ml）以下，培养时不能倒置，先正置一段时间等水分蒸发后倒置。平板划线法：把混杂在一起的微生物不同种的不同个体或同一种的不同细胞，通过带菌的接种环在培养基表面做多次划线的稀

5、释法， 能得到较多的独立分布的单个细胞， 经培养后即成单菌落。4、计算细菌数量原理：平板菌落计数法是实验室最常用的活菌计数法。在高度稀释条件下，待测样品中的微生物被分散成单个细胞，经过适当培养，每个细胞可以在固体培养基上形成单个菌落。 根据平板上长出的菌落来测定样品中的微生物数量的方法称为平板菌落计数法。 计数前， 需要对样品进行系列稀释，使其中的微生物分散成单个细胞， 否则一个菌落就不只代表一个细胞。 计数时， 需要取适当稀释度的菌液接种于固体平板培养基上， 否则会因菌落太多而无法准确计数。一般以直径 9cm 平板上出现 30300 个菌落为宜。采用本法测得的的菌数是培养基上生长出来的菌落数

6、量，故又被称为活菌计数法。计算悬液含菌数按以下公式：污泥液含菌数（个/mL）=平均菌落数稀释倍数5、菌落形态观察原理：由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特性及产生色素的能力等各不相同， 因而个体及它们的群体在固体培养基上生长状况各不一样。 按照微生物在固体培养基上形成的菌落特征，可从菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、菌丛高度、颜色、透明度、气味、粘滞性、质地软硬、表面光滑粗糙等情况，初步辨别是何种类型的微生物。三、三、实验器皿和试剂实验器皿和试剂1、待测样品：活性污泥2、仪器：干燥箱、 酒精灯、恒温培养箱、 高温灭菌锅、15 支试管、10ml 移液枪、移液枪头、500ml2

7、锥形瓶、250ml2 锥形瓶、玻璃珠、20 套培养基皿、2 支玻璃棒、100ml 量筒、500ml 量筒、50ml 烧杯、200ml 烧杯、250ml 烧杯、500ml 烧杯、PH 计、接种环、擦镜纸、打火机、记号笔等。3、试剂或材料：无菌水、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH、琼脂、Cu 离子母液等。四、实验步骤四、实验步骤一）实验前期准备1）洗涤：培养基、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲洗。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱烘干、备用。2）移液枪头和培养皿的包装： 培养皿由一底一盖组成一套， 用牛皮纸或报纸将 20 套培养皿和装有移液

8、枪头的盒子包好。 分别装有 90ml 蒸馏水和玻璃珠的锥形瓶也用牛皮纸包好瓶口。3）配制培养基：半固体培养基：称取1g 牛肉膏于 250ml 烧杯中，依次加入2g 蛋白胨、1gNacl、200ml 蒸馏水。用5%NaOH 调至所需 pH7.07.2，测定pH 可用 pH 计。调节pH 值时应缓慢加入试剂，边加边搅拌，并不时用 pH 计测试。在 500ml 锥形瓶加入 1g 琼脂，将烧杯中溶液倒入锥形瓶。固体培养基：称取 1.5g 牛肉膏于 500ml 烧杯中，依次加入 3g 蛋白胨、1.5gNacl、300ml蒸馏水。加入氢氧化钠溶液调节pH 值 7.07.2。在 500ml 锥形瓶加入 6g

9、 琼脂，将烧杯中溶液倒入锥形瓶。选择培养基：称取1g 牛肉膏于 250ml 烧杯中，依次加入2g 蛋白胨、1gNacl、200ml 蒸馏水。加入氢氧化钠溶液调节pH 值 7.07.2。在 250ml 锥形瓶加入 4g 琼脂，将烧杯中溶液倒入锥形瓶。4）配制稀释水：用 10ml 移液管吸取 9ml 蒸馏水至试管中（7 根），用试管塞塞紧。5）器材和培养基的灭菌： 铜离子母液用膜过滤灭菌。 将含有玻璃珠的锥形瓶、 小烧杯、 250ml烧杯、包装的培养皿放置在电热干燥箱。其余的待灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅中，以121、1kg/cm2 压力，灭菌 15-20min。灭菌后的培养基应置于生化恒温培养箱内

10、，恒温37培养 48h，确定无菌后方可使用。6）倒平板：将液体冷却到50左右，右手持液体，左手拿培养皿，倒入约1/2 培养皿，盖好皿盖，轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，冷却成平板，待用。7）制作 4 支斜面：调节 5ml 移液枪的量程，装上枪头，吸取5ml 培养基至试管，倾斜放置试管。斜面的长度不超过试管长度的二分之一， 摆放时不可使培养基沾污。 冷凝过程中勿移动试管。8）制作 4 支半固体培养基：调节 5ml 移液枪的量程，装上枪头，吸取5ml 培养基至试管，竖直放置试管。9）选择培养基倒平板： 液体冷却到 50左右，用移液枪在锥形瓶中加入1ml 铜离子母液。右手持液体，左手拿

11、培养皿，倒入约1/2 培养皿，盖好皿盖，轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，冷却成平板，待用。二）实验步骤1）制备污泥稀释液称取 10g 底泥于烧杯中， 用 90ml 灭菌水冲洗至锥形瓶中，振荡 20min。2）稀释用 1ml 移液枪吸取 1ml 已充分混匀的污泥悬液至装有 9ml 灭菌水的试管中，吹吸 3 次，得到10-2 稀释液，用记号笔做好标记。换一支枪头吸取 10-2 稀释液 1ml 至装有 9ml 灭菌水的试管中， 吹吸 3 次， 得到 10-3 稀释液，标记。依此类推，得到 10-4,10-5,10-6稀释液。3）涂布培养 3.1 取样接种：用记号笔做好标记，分别用 1m

12、l 移液枪吸取 0.2ml10-3,10-4,10-5 稀释液加至对应的固体培养基中（不含Cu 离子），每个浓度做 2 个重复，外加一个空白。分别用 1ml 移液枪吸取 0.2ml10-2,10-3稀释液加至对应含 Cu 离子的培养基中， 每个浓度做2 个重复。 3.2 涂布平板：右手拿无菌三角刮刀，左手拿加好稀释液的平板，将皿盖在火焰旁打开一条缝进行涂布。涂布时，使无菌三角刮刀沿着同心圆方向轻轻地向外扩展， 让稀释液均匀分布至整个平板。 3.3 倒置培养：在室温静止 10 分钟左右，使菌液渗入培养基。然后，将平板培养基倒置于 37培养箱中培养 24h，平板表面长出菌落。4） 结果观察与计数从

13、三个稀释度中选择一个合适的稀释度， 求出被测样品中的含菌数。 筛选适宜稀释度（即计算稀释度）的标准是：a.在每个平皿中，细菌、放线菌、酵母菌的菌落数为30 到 300 个，霉菌菌落数为10 到 100个。b.同一稀释度的各个重复之间，菌落数不能相差太大。c.从低稀释度到高稀释度，以菌落数递减10 倍为基础，各稀释度间的递减误差越小越好。三）抗 Cu 细菌分离、纯化1）划线在近火焰处，左手拿皿底，轻轻地打开一条缝， 右手拿接种针从前一天培养好的培养皿菌落中挑取 2 种菌落，进行平板划线和斜面划线，每个菌种2 个重复，一个空白。a.平板划线：用接种针以无菌操作挑取选好的菌落,先在平板培养基的一边作

14、第一次连续划线 3-4 条,再转动培养皿约 70角，并将接种针上残菌烧掉，冷却后通过第一次划线的部分作第二次连续划线， 再用同样的方法做第三次划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于 37恒温培养箱内培养 24-48h。b.斜面划线： 左手拿斜面培养基， 右手拿接种针，在火焰旁用右手小指、无名指和手掌夹住棉花塞将它拔出， 试管口在火焰上微烧一周。 用烧过的已冷却的接种针挑取菌落立即转移至待接种试管斜面上，自斜面底部开始向上做“Z”形致密划线至斜面顶端，抽出接种针，试管过火后塞上棉塞，放回试管架。在37培养箱中培养 24h，观察结果。2） 穿刺实验：用接种针挑取单菌落，不要弯折，不要触底，笔直伸入

15、半固体培养基中。然后沿穿刺线缓慢地抽出接种针灼烧灭菌，试管过火后塞上棉塞，则接种完毕。四）菌落形态的观察1、将自己培养筛选的细菌菌落逐个辨认并编号，按号码顺序将各细菌的菌落特征描述、记录。2、绘制菌落形态图。3 、 与 细 菌 、 放 线 菌 、 酵 母 菌 以 及 霉 菌 聚 落 特 征 进 行 比 较 ， 做 详 细 记 录 。五、数据记录五、数据记录1、菌落数量12410-42平均433310-512平均666编号稀释度菌落数/平板10-312平均300300300菌落总数3*105 个3.3*105 个6*105 个稀释度编号1210-22平均22*102 个21110-32平均11*103 个1菌落数/平板菌落总数（抗 Cu）2、菌落形态（左图所示培养基为选取菌种进行下步培养的培养的基）菌落正反面颜色的差别菌落在菌落形半固体态与培培养基养基结中生长合程度状况结合不紧沿直线生长自由生长编菌落透直径号明度形状凹凸菌落颜色10.3c不透明圆形凸m米黄色一致0.2c2不透明圆形凸m0.4c3不透明圆形m凹反面结合不乳白色白色紧反面结合不米黄色白色紧结合不黑色一致紧抗0.5m不透明圆形凹Cum六、结果分析