最近频繁用到酶标仪,对OD值和吸光度值(abs)的概念和其线性范围不甚理.pdf

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1、最近频繁用到酶标仪， 对 OD 值和吸光度值(abs)的概念和其线性范围不甚明白得， 查了很多资料，包括园子里先辈的总结和我从其他网站上取得的， 也包括我个人的明白得， 在此做更全面的总结（因为园子里的都是 N 年前的老帖子，且不是很全面，呵呵）希望能供战友们参考1、首先明白什么是朗伯比尔定律朗伯比尔（Lambertbeer）光吸收定律：AlgTb cA吸光度，又称光密度“”。T透光度， TI / I。 ， I。为照射到吸收池上的光强，I为透过吸收池的光强。摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L?mol1?cm1） 。b样品光程（cm） ，通常利用 1.0cm 的吸收地，b=1cm。C?样品浓度（m

2、ol/L） 。由上式可以看出：吸光度A 与物质的吸光系数“”和物质的浓度“C”成正比。2、OD 值定义OD 值(optical density)表示某一物质在某一个特定波长下的吸光度； ABS 是吸光值absorbance的缩写. 在分析化学里,某一化学物质都可吸收一定波长的光,并且对光的吸收度与此化学物质的浓度成正比.因此可以利用吸光度的大小来测定某种物质的浓度.其中某物质在特定波长下对光的吸收度,就是 OD 值,一般用经过石英管后的光强比上照射到石英管前的光强来表示.3、吸光度值（abs/AU）定义吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物

3、质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等。吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关， 只要光的波长被固定下来， 同一种物质，吸光系数就不变。当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用 A 表示。Aabc，其中 a 为吸光系数，单位 L/(gcm),b 为液层厚度（一样为比色皿的厚度） ，单位 cm ， c 为溶液浓度，单位 g/L影响吸光度的因数是 b 和 c。a 是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响 c，而影响 A。符号 A，表示物质对光的吸收程度。 97801 式中 I0 是通

4、过均匀的液体介质的一束平行光的入射光的强度；It 是透射光强度；T 是透射比。A 值越大，表示物质对光的吸收越大。根据比尔定律，吸光度与吸光物质的量浓度 c 成正比，以 A 对 c 作图，可得到光度分析的校准曲线。在多组分体系中，如果各组分的吸光质点彼此不发生作用， 那么吸光度便等于各组分吸光度之和， 这一规律称吸光度的加和性。 据此可以进行多组分同时测定及某些化学反应平衡常数的测定。在吸光度测定中，为抵消吸收池对入射光的吸收、 反射以及溶剂、试剂等对入射光的吸收、散射等因素，可选用双光束分光光度计， 并选光学性质相同、厚度相等的吸收池分别盛待测溶液和参比溶液。4、国外资料的权威总结Optic

5、al density can also refer to index of refraction.In spectroscopy, the absorbance A ( also called optical densityalso called optical density) is defined as: A=log10(I0/I)where I is the intensity of light at a specified wavelength that has passed through a sample(transmitted light intensity) and I0 is

6、 the intensity of the light before it enters the sample orincident light intensity (or power). Absorbance measurements are often carried out in analyticalchemistry, since the absorbance of a sample is proportional to the thickness of the sample and theconcentration of the absorbing species in the sa

7、mple, in contrast to the transmittance I / I0 of asample, which varies logarithmically with thickness and concentration.Absorbance vs transmittanceAbsorbanceTransmittance (I / I0)Percent transmittance (100 * I / I0)011000.10.79790.250.56560.50.32320.750.18180.90.131310.11020.01130.0010.1Instrument m

8、easurement rangeInstrument measurement rangeAny real measuring instrument has a limited range over which it can accurately measureabsorbance. An instrument must be calibrated and checked against known standards if the readingsare to be trusted. Many instruments will become non-linear (fail to follow

9、 the Beer-Lambert law)starting at approximately 2 AU (1% Transmission). It is also difficult to accurately measure verysmall absorbance values (below 10?4) with commercially available instruments for chemicalanalysis. In such cases, laser-based absorption techniques can be used, since they havedemon

10、strated detection limits that supersede those obtained by conventional non-laser-basedinstruments by many orders of magnitude (detections have been demonstrated all the way down to5 10?13). The theoretical best accuracy for most commercially available non-laser-basedinstruments is in the range near

11、1 AU. The path length or concentration should then, when possible,be adjusted to achieve readings near this range.5、再看看园子里的精华总结OD 值1.朗伯比尔（Lambertbeer）光吸收定律：AlgTb cA吸光度，又称光密度“”。T透光度， TI / I。 ， I。为照射到吸收池上的光强，I为透过吸收池的光强。摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L?mol1?cm1） 。b样品光程（cm） ，通常利用 1.0cm 的吸收地，b=1cm。C?样品浓度（mol/L） 。由上式可以看出

12、：吸光度A 与物质的吸光系数“”和物质的浓度“C”成正比。2.DNA 和 RNA 的 OD 值2.1原理嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在 240290nm 的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。 DNA 钠盐的紫外吸收在 260nm 附近有最大吸收值（图 3-25） ，在 230nm 处为吸收低谷，其吸光率（absorbance）以 A260 表示，A260是核酸的重要性质，RNA 钠盐的吸收曲线与 DNA 无明显区别，蛋白质在 280nm 处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm 处，对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶

13、液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1gmL 的核酸水溶液在 260nm 处的吸光率，天然状态的双链DNA 的比吸光系数为 0.020，变性DNA 和 RNA 的比吸光系数为 0.022。 据朗波比尔光吸收定律A-lgTbc 知， cA/b， 而 b 一样为 1cm，因此， 通常以 1OD 值相当于 50gmL 双螺旋 DNA， 或 40gmL 单螺旋 DNA （或 RNA） ，或 20gmL 寡核苷酸计算。2.2纯度DNA 和 RNA 的纯度可以通过测定260nm， 230nm 和 280nm 的紫外吸收值来测定， 纯的 DNAOD260280 在 1.8-1.9，OD260230 应大

14、于 2.0，纯的 RNA OD260280 在 1.9-2.0，如果DNA 比值高于 1.8-1.9，可能有RNA 没有去除干净，如果DNA 比值小于 1.8-1.9，可能含有酚或者蛋白质（RNA 中含有酚或者蛋白质比值也会降低） ，若 OD260230 小于 2.0 说明有残存的盐或小分子杂质污染。2.3浓度DNA 和 RNA 的量，据朗波比尔光吸收定律A-lgTbc 知测量样品的浓度为 cA/b，又知 1）50A，那么未稀释的样品的浓度为 50A稀释倍数（gmL）50A稀释倍数/1000（mgmL）2.4注意事项：1)比色杯应为石英杯，玻璃杯在此波长时读数不准。2)检测时应使 OD260

15、值在 0.15 到 1.0 之间，数值比较准确。3)这种比值测定的方法仅仅适用于核酸浓度大于0.25ulml 的时候， 浓度小于 0.25ulml的时候测量误差较大。4)既含有 RNA 又含有蛋白质也可能使比值维持在1.8， 这个时候要根据电泳情况鉴定是不是含有 RNA，或者测定一下是不是含有蛋白质；5)A260/A280 比值可提供 DNA 纯度的一个参考，但A260/A280 比值会受 pH 影响。如果未调 pH，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在10 mM Tris Cl, pH 8.5 中检测，此时纯净的 DNA A260/A280比值应为 1.8-2.0（注意应使用同样

16、缓冲液作为对照） 。6)进行 OD 值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD 值。7)可以在 220-330 nm 之间进行扫描，此扫描可以检测是否有其它因素影响OD260，如在325 nm 处有吸光值说明有污染物或比色皿不干净。)8)DNA 的量与 260 nm 处的吸光度值（OD 值）成正比，在引物设计时，1 个 OD 值的合成 DNA 的重量约为 33 mg。MTT 也是有一定量的。细胞数量不同，同样细胞数接触到的MTT 量就不一样。而 MTT 浓度越高，细胞染色越深。所以经常遇到这样的情况，细胞数明显少了，可MTT 测出的 OD值却一样，如果细心的话你可以发现，细胞少的那组

17、，单个细胞的染色很深。所以如果细胞数不是有很大的差别，MTT 是看不出来的。计数吧，呵呵_酶标仪也是紫外光谱，紫外的有效测定范围 0.11.0，超出此范围后虽然可以显示值，但是不是呈线性了，就不准确了。测 MTT 时如果值超出 1，就应该稀释，用原来的溶剂稀释即可。OD 是 optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里出现的专有名词 一般人理解较困难 具体检测涉及到很多物理等方面知识 你只须知道是阴性即可光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量， 特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。检测单位用 OD 值表示， O

18、D 是 optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， OD1og（1trans） ，其中 trans 为检测物的透光值。吸光度吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。 只要光的波长被固定下来， 同一种物质，吸光系数就不变。当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用 A 表示。Aabc， 其中 a 为吸光系数， 单位 L/(

19、g?cm),b 为液层厚度 （通常为比色皿的厚度） ， 单位 cm ，c 为溶液浓度，单位 g/L影响吸光度的因数是 b 和 c。 a 是与溶质有关的一个常量。 此外， 温度通过影响 c， 而影响 A。1 污染细菌可导致 OD 过高。 细胞过多一般会减小方差，而不会增大之。因为细胞长满后，生长速度会减小，包括肿瘤细胞。如果 OD 太大，可吸出一半溶剂，再加入相同体积溶剂，重测。以减小OD 值。2 每组的 6 个数，删除 2 个离群值（可以是最大值和最小值， 也可以是 2 个最大或 2 个最小值） ，只统计 4 个。3 血清不影响 MTT 实验。但我对 HT-29不清楚。4 请参考文献中关于 H

20、T-29的 MTT 实验方法。不管做 WST-1和已过时的 MTT，仍是做 Elisa、测 RNA 纯度等都会用到酶标仪，而且之前都以为OD值在2之内才知足线性关系， 可是我看了一下Thermo Scientific Varioskan Flash 酶标仪的说明书，里面说 96 孔板只要 0-4 的吸光度值都知足线性关系Linearity (Photometry)Linearity (Photometry)0 to 4 Abs, (96-well plate) at 450nm,0 to 4 Abs, (96-well plate) at 450nm, 2%2%0 to 3 Abs (384-

21、well plate) at 450nm,0 to 3 Abs (384-well plate) at 450nm, 2%2%Accuracy (Photometry)Accuracy (Photometry) 2% or 0.003 Abs, whichever is greater, at 200 to 399nm (0 to 2 Abs)2% or 0.003 Abs, whichever is greater, at 200 to 399nm (0 to 2 Abs) 1% or 0.003 Abs, whichever is greater, at 400 to 1000nm (0

22、to 3 Abs)1% or 0.003 Abs, whichever is greater, at 400 to 1000nm (0 to 3 Abs)Precision (Photometry)Precision (Photometry)SD 0.001 Abs or CV 0.5%, whichever is greater, at 450nm (0 to 3 Abs)SD 0.001 Abs or CV 0.5%, whichever is greater, at 450nm (0 to 3 Abs)注意这里只是在波长为注意这里只是在波长为 450nm450nm 和和 9696 孔板的情况下，孔板的情况下， 04Abs04Abs 才满足线性关系，才满足线性关系， 而且偏差在而且偏差在2%关于某些实验误差已经超级大。