免疫组化的基本步骤.pdf

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1、免疫组化步骤1.4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置 20%蔗糖溶液（4）中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01MKPBS 清洗 5min3 后；2.加入配好的 0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇 80ml0.01MKPBS 100ml30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS 清洗 5min3；3.加入配好的 0.3% Triton X100（30% Triton X1000.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS 清洗 5min3；4.加入用血清稀释液 （牛血清白蛋白 1.00g0.01MPBS 100ml叠氮纳 0.08

2、g） 稀释的一抗，4存放 24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS 洗 5min3；5.加入 0.01MKPBS 稀释的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS 洗 5min3；6.加入 ABC 复合物之类的抗体，室温孵育 2h，0.01MKPBS 洗 5min3；蒸馏水迅速冲三次；7.加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS 终止反应；8.梯度酒精脱水之后，封片，拍照。免疫组化主要步骤1.洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的

3、硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整 ,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓 H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于 37C 温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。2.包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。3.切片：将包埋好的组织从模具上取下来， 并置于石蜡切片机上， 切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片

4、的厚度，一般为 5µm,如果比较难切，则可以适当调整厚度， 用毛笔将切割的载玻片向外拉， 并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于 40C 温水中。4.捞组织：当组织载玻片置于 40C 温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹， 用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下 1/3 或者下 1/2 一般每种组织捞 5-6 张，其中 2-3 张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织， 做对照使用，这样形成的误差就比较小了， 而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入 37C 温箱中烘干。5.脱蜡：依次将载玻

5、片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放 10min,天气热可以少放几分钟 ,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间 ,一般为12-15min.6.抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2 浸泡 10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮 3min （中火） ， 一般刚到沸腾即可， 冷却至室温， 然后再蒸煮一次， 冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。7.血清封闭：冷却至室温

6、后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗 2 次，并将载玻片置于 PBS 中5min，洗 2 次，擦干组织周围的 PBS 液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入 37C 温箱中半小时。血清稀释 10 倍（900µlPBS：100µl血清封闭液） 。8.加一抗：将温箱中的载玻片取出， 用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清， 加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加 PBS。加完一抗后于 4C 冰箱中保存过夜。9.加二抗：将载玻片从冰箱中取出， 放入 PBS 中洗 3 次，每次 5min，擦干组织周围的 PBS后加上二抗,然后置于 37C 温箱中半小时。10.

7、 加 SABC:将片子从温箱中取出, 放入 PBS 中洗 3 次，每次5min，擦干组织周围的PBS 后加上 SABC, 然后置于 37C 温箱中半小时。 SABC 稀释 100 倍（990µlPBS：10µlSABC） 。11. 加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入 PBS 中洗 3 次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。 （显色剂的配置：在 1ml 水中加 1 滴显色剂 A，摇匀，然后加 1 滴显色剂 B，摇匀，再加1 滴显色剂 C，摇匀）A：DABB：H2O2C：磷酸缓冲液12. 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后， 浸泡于苏木精中染色， 一般

8、动物组织为半分钟，植物组织 3-5min。13. 脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入 70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置 2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。14. 封片：用中性树胶滴在组织旁边， 再用盖玻片盖上，要先放平一侧， 然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。免疫组化操作步骤一. 免疫组化（ LP 法）操作步骤 ：1切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 3min/2 次。3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 H

9、ydrogen PeroxideBlock 中孵育 10-15 分钟。4. 缓冲液洗 5min/2 次。5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。（注： 孵育不要超过 10 分钟， 否则会导致特异性染色降低。 如果一抗的稀释液中含有 5 10% 正常羊血清，这一步可以省略。 ）6. 缓冲液洗 5min/2 次。7. 滴加一抗工作液 37 孵育 1 2 小时。 （具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 5min/2 次。9 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。10 缓冲

10、液洗 5min/2 次。11 滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。 ）12 缓冲液洗 5min/2 次。13 向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen（或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 15 分钟。 （具体时间由染色深浅决定。 ）14 自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。二免疫组化 ( 三步法 )

11、操作步骤 ：（ 1 ） 、石蜡切片脱蜡至水。（ 2 ） 、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。（ 3 ） 、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行） 。（ 4 ） 、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 孵育 1-2 小时或 4 过夜。（ 5 ） 、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。（ 6 ） 、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 孵育 10-30 分钟。（ 7 ） 、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。（ 8 ） 、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 孵育 10-30分钟。（ 9 ） 、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。（ 10 ） 、显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ）（ 11 ） 、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。三. 冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片 4-8um ，室温放置 30 分钟后，入 4 丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟 x3，用过氧化氢孵育 5-10 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。以下同石蜡切片免疫组化