平邑甜茶mhwrky15基因的克隆及表达分析-孙晓莉.pdf

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1、山东农业大学 硕士学位论文 平邑甜茶MhWRKY15基因的克隆及表达分析 姓名：孙晓莉 申请学位级别：硕士 专业：果树学 指导教师：杨洪强 2011-06-08山东农业大学硕士学位论文 1 中文摘要 转录因子是结合在目的基因特定DNA序列上的蛋白质， 它通过增强或抑制基因的转 录效率来调控基因的表达水平，真核生物的基因表达调控主要是在转录水平进行。 WRKY转录因子作为一种重要的诱导型调节因子，参与植物的多种防卫反应、生长发育 调节以及物质代谢调节等各种重要生理活动。 平邑甜茶（Malus hupehensis (Pamp) Rehd. var pinyiensis Jiang）是我国特有的植

2、物资 源，常用作苹果和观赏海棠的砧木。本研究以平邑甜茶为试材，克隆了MhWRKY15基因 的全长cDNA序列， 并运用生物信息学手段分析了其基因序列与编码蛋白的性质和功能； 同时，研究了其在生长过程及逆境胁迫下的表达情况，并成功构建RNAi载体并转化拟 南芥，获得转基因拟南芥植株。主要结果如下： 1). 获得了平邑甜茶 MhWRKY15基因，该基因 cDNA 全长 1091bp，含有 810bp的完整 开放阅读框，编码 269个氨基酸，属于 WRKY 类转录因子的第 II组，为 WRKY15家族 成员。GenBank 登录号为 GU576874。 2). 生物信息学分析表明，MhWRKY15编

3、码蛋白为可溶性蛋白，其分子式为 C 1263 H 1941 N 365 O 425 S 12 ，相对分子量为29423.2Da，理论等电点为5.30；含有一个WRKY保 守结构域，无跨膜域，无信号肽，存在磷酸化、N糖基化和O糖基化位点；其二级结构 主要以无规则卷曲为主。 3). 构建了 pCAMBIA1390-MhWRKY15-GFP 表达载体，亚细胞定位结果表明平邑甜茶 MhWRKY 定位于细胞核。 4). 构建了基因沉默载体 pFGC5941-RNAi-MhWRKY15，并通过花序侵染法转化拟南芥， 通过抗性筛选和 PCR检测，得到 11株转基因再生阳性植株。 5). 半定量RT-PCR表

4、明，平邑甜茶MhWRKY15基因的表达受NaCl、PEG、低温及机械伤 害等胁迫诱导，并且具有组织特异性，叶片中的表达水平高于茎和根系。 关键词：平邑甜茶；WRKY15基因分离；RNAi；拟南芥转化；半定量 RT-PCR 平邑甜茶 MhWRKY15基因的克隆及表达分析 2 Isolation and Expression Analysis of MhWRKY15 in Malus hupehensis (Pamp) Rehd. Abstract Transcription factors were proteins that binding with specific DNA sequence

5、s of target gene, which could regulate gene expression by enhancing or inhibiting the efficiency of gene transcription. Regulation of the gene expression in eukaryotic was mainly at the transcriptional level. WRKY transcription factor was an important inducible regulatory factor which participated i

6、n a variety of important physiological activities, such as plant defense responses, growth regulation and metabolism regulation. Malus hupehensis (Pamp) Rehd. var pinyiensis Jiang (Chinese name is Ping Yi Tian Cha, PYTC) was the unique resource in our country, which was used widely as a common roots

7、tock of apple and ornamental crabapple. In this thesis, the full-length cDNA of MhWRKY15 gene was isolated based on the materials of PYTC roots, the character and function of the gene sequence and the protein that it encoded was analyzed by bioinformatics. At the same time, the expression pattern of

8、 MhWRKY15 during growth process and under various sresses was studied. Otherwise, transgenic arabidopsis thaliana transformed with RNAi vector of MhWRKY15 gene was obtained by floral dip transformation. The main results were as follows: 1. The full longth cDNA of MhWRKY15 was obtained. According to

9、the homologous sequences from other plants, degenerate primers were designed to amplify specific DNA fragment using cDNA prepared from PYTC roots. MhWRKY15 was 1091bp in length, containing an open reading frame of 810bp and encoding 269 amino acids, and it was belonged to group II of WRKY transcript

10、ion factors and was one number of WRKY15 family, and the accession number of GeneBank was GU576874. 2. Bioinformatics analysis indicated that the protein encoded by MhWRKY15 was a soluble protein, with the molecular formula was C 1263 H 1941 N 365 O 425 S 12 , the relative molecular weight was 29423

11、.2Da and isoelectric point was 5.30. There was one conserved WRKY domain in the protein sequence, and the sequence identity to M. domestica and G. max was over 96%. 山东农业大学硕士学位论文 3 The protein was located in nucleus, and there were many phosphorylation sites, N glycosylation sites and O glycosylation

12、 sites, but no transmembrane domain and signal peptide. The predicted secondary structure demonstrated that random coil was the most important structural conformation. 3. The pCAMBIA1390-MhWRKY15-GFP vector was constructed to study subcellular localization of MhWRKY, and the result showed that MhWRK

13、Y15 was localized in nucleus. 4. The RNAi vector of pFGC5941-RNAi-MhWRKY15 was also constructed in this study and transformed Arabidopsis thaliana col-0 using the floral dip method via agrobacterium mediated. Harvest seeds were put on MS medium containing glufosinate in order to select the resistant

14、 seedlings. Genomic DNA of resistant seedlings was extracted for PCR detection. In the end, 11 transgenic seedlings were identified, which lay the foundation for the further study of the function of MhWRKY15. 5. According to the analysis of semi RT-PCR，MhWRKY15 gene expression could be induced by hi

15、gh salinity stress, drought stress, low temperature and mechanical injury, and had tissue specificity, the expression level in leaf was higher than root and stem. Key words: Malus hupehensis (Pamp) Rehd.; WRKY15 gene isolation; RNAi; Transformation of Arabidopsis thaliana; semi RT-PCR 英文缩写符号及其中英文对照表

16、 英文缩写 英文名称 中文名称 2, 4-D 2，4-dichlorophenlxyacetiacid 2,4-二氯苯氧乙酸 6-BA 6-benzyladenine 6-苄基腺嘌呤 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 bp B ase P air 碱基对 BSA Bovine serum albumin 牛血清蛋白 CaMV35S 35S promoter of califlower mosoic virus 花椰菜花椰病毒 35S启动子 cDNA Complementary DNA 互补 DNA Cef Ceftriaxone sodium 头孢曲松钠 Crb Carbenicill

17、in 羧苄青霉素 CTAB Cetyltrimethylammol/lonium bromide 十六烷基三乙基溴化铵 ddH 2 O Distilledant deionized water 重蒸水 DEPC Diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 dNTP Deocyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 E.coli Escherichia coli 大肠杆菌 EB Ethidium bromide 溴化乙锭 EDTA

18、Ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 KAC Kalium acetate 醋酸钾 K an K anam ycin 卡那霉素 L B L uria-bertani m edium L B培养基 MOPS 3-(N-morphplino) propanesulfonic 3-N吗啉代丙磺酸 mRNA Message RNA 信使 RNA MS Murashige and Skoog media MS培养基 NaOAC Sodium acetate 醋酸钠 R if R if am picin 利福平 RNA Ribonucleic acid 核糖核酸

19、 RNase A Ribonuclease A 核糖核酸酶 A rpm Revolutions per minute 转/分钟 RT-PCR Reverse transcriptative PCR 反转录 PCR SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 STET Sodium chloride, Tris-HCl, EDTA NaCl, Tris-HCl, EDTA缓冲液 buffer TE Tris-HCl, EDTA buffer Tris-HCl、EDTA缓冲液 Tris Ttrishydryxymethy laminomethane 三羟甲基氨基甲烷 -N

20、AA -napthalene acetic acid -萘乙酸 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得 的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体， 均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学 校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论 文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论

21、文 收录到中国学位论文全文数据库，并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导 师 签 名： 日 期： 平邑甜茶 MhWRKY15基因的克隆及表达分析 4 前言 转录因子是结合在目的基因特定DNA序列上的蛋白质， 它通过增强或抑制基因的转 录效率来调控基因的表达水平，真核生物的基因表达调控主要是在转录水平进行 （Prez-Rodrguez P., 2010）。WRKY转录因子作为一种重要的诱导型调节因子，参与 植物的多种防卫反应、生长发育调节以及物质代谢调节等各种重要生理活动（Cai et al., 2008；Eulgem et al., 2000）。 WRK

22、Y 是植物特有的一种 N-端含有 7个绝对保守的氨基酸序列（WRKYGQK）及 锌指结构（CX 47 CX 2223 HXH/C）的转录调控因子（Paul et al，2010；Shree et al， 2009），它能够通过与核心序列为(T)(T)TGAC(T/C)的 W-box顺式元件特异结合而调节 基因的表达（Cai et al，2008；Van-Verk et al，2008）。它们明显受真菌（Chloe et al，2007；Xing et al，2008）、冷害、高温、干旱及盐胁迫（Mare et al，2007； Rizhsky et al，2002；Seki et al，200

23、2） 等诱导并参与胚胎形成（Lagace et al， 2004）、种皮及腺毛发育（Johnson et al，2002）等多种过程，是植物生长发育和环境 适应过程中的重要调节因子。研究该类基因的表达特性及调控机理，对于阐明植物对生 物胁迫和非生物胁迫反应的分子机制具有重要意义，也是通过基因工程改良植物抗逆性 状所必须做的基础性工作。 1.1 WRKY的结构特征及其分类 高等植物典型的转录因子一般由4个功能区域组成，即：DNA结合域、转录调控域、 核定位信号和寡聚化位点。 WRKY转录因子最主要的结构特点是各成员的DNA结合域中 都至少含有一个由大约60个高度保守的氨基酸残基所组成的WRKY结

24、构域，其中N端具 有的WRKYGQK氨基酸残基在所有成员中基本绝对保守， 这也是WRKY转录因子命名的 由来。 WRKY转录因子的C端是一个C2H2 （氨基酸组成模式： C-X45-C-X2223-H-X1-H） 或C2HC（氨基酸组成模式： C-X7-C-X23-H-X1-C）的锌指结构（Eulgem et al， 2000）。 WRKY转录因子另一个重要特征是绝大多数WRKY域中都含有内含子， 并且存在的位置 高度保守（Eulgem et al， 2000），可能是参与调节转录后加工过程。如在TLR（toll-like receptor）类信号分子中存在不同的内含子剪切机制，在信号转导中起

25、重要作用（Jordan et al，2002）。在WRKY域中共有两种类型的内含子：一种是位于编码R（精氨酸） 的位点，在密码子AGG中的两个GG之间剪接，称为R型内含子；另一种内含子在编码V山东农业大学硕士学位论文 5 （缬氨酸）的位点前剪接，V位于锌指结构C2H2的第2个C（半胱氨酸）之后的第6个位 点，称为V型内含子（Wu et al，2005）。 目前， 在拟南芥和水稻中分别发现了74个和109个WRKY成员 （Eulgem et al ， 2007； Ross et al，2007）。根据转录因子所含WRKY结构域的个数和锌指结构的特征，一般 将WRKY转录因子分为3大类：第I类WR

26、KY转录因子含有2个WRKY结构域，且其锌指 结构类型为C2H2(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)型，如PcWRKY1、 IbSPF1、AtZAP1、 NtWRKY1、 NtWRKY2和CsSE71等。该类WRKY转录因子的DNA结合功能主要由C端的 WRKY结构域主导，而N端WRKY结构域的功能尚不清楚，可能参与WRKY转录因子与 DNA相互结合的过程，从而提高转录因子结合靶位点的亲和力和特异性；第II类WRKY 转录因子只含有1个WRKY结构域， 其锌指结构也为C2H2(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)型， 大部分研究过的WRKY转录因子都属于该类型，如PcWR

27、KY3、 PcWRKY4、 AtWRKY15 和NtWIZZ等，II类WRKY转录因子的WRKY结构域序列与I类WRKY转录因子C端 WRKY结构域序列的相似性比N端WRKY结构域序列的相似性更高， 这也说明I类WRKY 转录因子C端WRKY结构域与其它类型中只有1个WRKY结构域的功能相同，即与靶 DNA互相结合；第III类WRKY转录因子也只含有1个WRKY结构域，但其锌指结构为 C2HC(C-X7-C-X23-H-X1-C)型，如PcWRKY5、NtWRKY4和NtWRKY5等。WRKY基因 的编号多采用WU等（Wu K L et al，2005）的顺染色体位置命名法，随着更多WRKY

28、基因的发现，现主要采用随机编号的方式依次将新发现的基因顺次编号（Qiu Y P et al., 2004；Zhang Z L et al., 2004；Xie Z et al., 2005；Ross C A et al., 2007）。 最初认为WRKY域中WRKYGQK七肽是不变的（Eulgem T et al， 2000），事实上， WRKYGQK中氨基酸残基并非完全保守， 例如STHP的C末端WRKY域为WPKYGQK （第 二残基由R变为P）（Huang et al，2002）。但是结果显示它仍能与W盒结合，具有相 同的生物活性。对推定的水稻和拟南芥WRKY蛋白进行分析（Wu et a

29、l.，2005）表明： 第3位R和第7位K，还有G和Q都有变化的例子。在水稻中，Q在大多情况下变成E或K， R变成I、K或S。Mae等（2001）认为，W、R、K、Y和锌指纹基元上的任何变化都会降 低、甚至完全丧失WRKY蛋白与DNA的结合活性。上述WRKYGQK区域发生变化的蛋 白能否与DNA元件结合，对证明它们是否仍然具有生物学功能具有重要意义。 1.2 WRKY 转录因子的结构域 转录因子蛋白是通过与靶基因启动子区特定核苷酸序列的特异结合来调控靶基因平邑甜茶 MhWRKY15基因的克隆及表达分析 6 的转录。多种体内或体外实验研究表明： WRKY转录因子的WRKY结构域能特异性的与 (T

30、)(T)TGAC(C/T)序列 （W-box） 相互作用。 已知的WRKY蛋白绝大部分均与W盒 (W-box) 顺式元件结合（Eulgem et al.，2000）。W盒序列元件含有不变的核心序列TGAC，对 WRKY转录因子与W盒结合是必不可少的。通过凝胶电泳迁移改变实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）发现，W-box保守核心序列中的TGAC任一核苷酸被替换， WRKY转录因子与之结合的能力将大幅下降或完全消失（Yang et al，1999）。研究表 明，W盒多存在于防御相关基因或创伤应答基因的启动子区域。从与合成的包含W盒的 DNA序

31、列结合实验中发现拟南芥的WRKY33基因参与病原物的响应（Lippok et al， 2007）。对拟南芥在14种不同 SAR (system acquired resistance) 诱导或抑制条件下的基 因表达进行微阵列研究，结果表明一组可同时诱导包括PRi基因的26个基因中，每个启 动子含有几个W盒，而随机选择的一组基因，每个启动子的W盒少于2个（Maleck et al,2000）。 WRKY转录因子一般是在细胞质中合成然后经跨膜运输转运到细胞核， 在转录水平 上对基因表达进行调控， 因此在WRKY转录因子的WRKY结构域区域外都存在细胞核定 位信号。另外，某些WRKY转录因子还含有转

32、录因子中常见的某些结构域，如介导转录 因子寡聚化的亮氨酸拉链，还有丝氨酸-苏氨酸丰富区、谷氨酸丰富区、脯氨酸丰富区 和酸性氨基酸区等。在WRKY转录因子中，除了比较保守的区域外，其余氨基酸组成的 序列同源性并不高。 1.3 WRKY转录因子的表达及其生物学功能 1.3.1 WRKY转录因子的表达特性 WRKY基因在植物体内并非组成型表达，而是受各种环境因子（如病原体、信号分 子、干旱、低温、创伤、机械胁迫等）的诱导表达，其表达具有快速瞬时等特点，同时 还具有组织特异性，在许多情况下不依赖于其他蛋白从无到有的合成。利用抑制性扣除 杂交的方法在叶片衰亡期对调控基因进行了差异表达分析，其中在植株生长

33、第6周的叶 片中WRKY53的mRNA转录本增长很快，到第7周表达量基本恒定，而到第8周呈急剧下 降趋势 (Miao et al,2007)。如皱叶欧芹受真菌诱导物的诱导，15min后与未受诱导的空 白对照相比，细胞中的WRKY4转录本已有积累，4590min之间达到最大值，而后迅速 下降 (Cormack et al,2002) 。 山东农业大学硕士学位论文 7 拟南芥有7个WRKY基因(AtWRKY40、AtWRKY33、AtWRKY53、AtWRKY22、 AtWRKY11、AtWRKY15、AtWRKY60)受伤害诱导表达(Cheong et al，2002)。其中， AtWRKY15

34、亦受水杨酸（SA）诱导，2mmol / L SA处理2-4h后其mRNA含量达到高峰 （Dong et al., 2003; Yu et al., 2004)。拟南芥与Pst DC3000（avrRpt2）不亲和互作时， AtWRKY15的诱导表达快速并持久；与PstDC3000亲和互作时表达延迟，但在接种后 6-12h稳定表达， 表明WRKY15参与诱导特异性病原基因的响应 （Journot-Catalino N et al., 2006）。烟草叶片机械创伤10min后，与对照相比，受伤的及上层未受伤的叶片中都有 WRKY转录本(WIZZ)积累，30min后达到最大值，然后开始下降(Hara

35、 et al，2000)。 一些WRKY蛋白还具有自我调控的能力。如拟南芥中WRKY6蛋白对其自身表达具 有明显的抑制作用，对其同一亚类的WRKY42的表达也有抑制作用，序列分析表明 WRKY6和WRKY42启动子中都含有W盒 (Rushton et al，2002) 。在皱叶欧芹的 PcWRKY1启动子中也含有W盒，WRKY1本身或其它WRKY蛋白能激活其表达(Eulgem et al，2002)。前一种自身抑制功能可能是WRKY蛋白的组织特异积累所需的；而后一 种自身激活功能预示着WRKY基因存在着某种组成型低水平的表达， 其产物是以无活性 状态存在于细胞质中，当接受外界诱导后被激活，如磷

36、酸化，然后激活WRKY基因的表 达。 1.3.2 WRKY转录因子在植物防卫反应中的作用 植物在长期的进化过程中，至少形成了两套生化防御系统以抵御来自外界的伤害。 一套防御反应由病原菌的侵染而引发，通过产生局部的过敏反应以预防病原菌的进一步 侵染，即系统获得性抗性(Systemic Acquired Resistance，SAR)；另一套防御反应主要是 通过各种信号分子激活植物体内防御基因的表达，从而使植物表现出对生物胁迫的抗性 反应，与此相关的主要信号转导途径有水杨酸信号转导途径、茉莉素信号转导途径、乙 烯信号转导途径和脱落酸信号转导途径等。 WRKY转录因子受各种生物胁迫和非生物胁迫的诱导

37、表达， 参与植物的胁迫应答反 应。Mare等（ Mare C et al，2004)从大麦中分离一个新的WRKY转录因子HvWRKY38， 该基因在干旱和冰冻处理时能持续表达，表明其与植物的冷胁迫和干旱胁迫应答相关， 同时HvWRKY38转录因子在植物非生物胁迫应答中起着调节作用；仇玉萍等克隆了13 个水稻WRKY基因，其中10个基因受NaCl、PEG、高温(42)和低温(4)等四种非生物 逆境因子胁迫的影响(仇玉萍，2004)。 平邑甜茶 MhWRKY15基因的克隆及表达分析 8 Yoda等（Yoda H et al，2004）从烟草中克隆出一个与WIZZ高度同源的WRKY转 录因子基因TI

38、ZZ，转基因烟草感染烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）后能诱 导TIZZ基因的表达，但无SA的积累，进一步证实植物中存在一种不依赖于SA的超敏反 应（hypersensitive response，HR）信号转导途径。在该途径中，转录因子TIZZ对植物防 御反应的激活起着重要作用。 Dong等研究了拟南芥防御应答过程中的72个AtWRKY的基 因的表达模式，结果发现49个AtWRKY基因在丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）侵 染或SA处理时表达水平发生了显著变化。AtWRKY18超表达可增强PR基因表达和提高 P.syringae的抗性。 K

39、alde等 （Kalde M et al ， 2003） 研究发现拟南芥中的13个型WRKY 转录因子处在不同的植物防卫信号转导途径中，如病原体侵染和水杨酸（salicylic acid， SA）信号转导途径等。 Li等（ Li J et al， 2006）以超表达WRKY70和基因敲除WRKY70 的拟南芥突变体为材料，通过利用真菌病原体甘蓝链格孢菌（Alternaria brassicicola）和 二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）侵染植物材料，结果表明：超表达WRKY70能提 高SA介导的Erysiphe cichoracearum抗性，但会降低JA介导的Alt

40、ernaria brassicicola抗性； 相反，基因敲除或下调WRKY70的表达则降低植物对SA介导的Erysiphe cichoracearum抗 性。因此推测WRKY70可能部分通过NPR1来抑制JA信号转导途径，同时WRKY70是平 衡植物SA、JA防卫信号途径的一个重要决定因子。 WRKY转录因子处于何种信号转导途径主要取决于其结合的启动子附近序列的特 异性。Xie等（Xie Z et al，2005）利用生物信息学方法从水稻中鉴定了81个OsWRKY 转录因子，并获得48个全长cDNA序列。在水稻糊粉细胞中，OsWRKY24、51、71、72 均能受ABA诱导表达，利用瞬时表达

41、分析系统表明OsWRKY24、45能抑制ABA诱导的 HVA22启动子活性，而OsWRKY72、77能与ABA协调作用激活该启动子的活性，说明 单子叶植物中的WRKY转录调节因子介导植物对ABA的应答；Zou等（Zou X et al， 2004） 从旱生常绿植物Larrea tridentata中分离克隆出LtWRKY21， 该转录因子能激活ABA 诱导基因启动子HVA22的活性， LtWRKY21转录因子与ABA、转录激活因子VP1、 ABI5 协调调控启动子HVA22的表达，进一步研究表明LtWRKY21可能与VP1、 ABI5形成一个 位于ABI1下游的功能复合物从而影响ABA调节基因

42、的表达；Park等发现AtWRKY7转录 因子具有一个钙调蛋白（Calmodulin-binding domain，CaMBD），且能与钙调蛋白 （Calmodulin，CaM）结合，表明其在CaM介导的Ca 2+ 信号转导过程起重要作用；同时 发现AtWRKY7转录因子所属的II类WRKY转录因子均具有保守的CaMBD，表明该类 WRKY转录因子在CaM介导的Ca 2+ 信号转导过程均具有一定的作用。 山东农业大学硕士学位论文 9 1.3.3 WRKY转录因子在植物形态建成中的作用 Johnson等研究发现， WRKY转录因子与控制植物形态发生有关， 认为拟南芥WRKY 类转录因子TTG2基

43、因至少调控三个不同的形态发生过程：毛状体发育、外层种皮中植 物黏液的产生和内种皮中单宁酸的生成，还可能与根发育有关。拟南芥ZAP1 （AtWRKY1）基因仅在根和花组织细胞中表达，而在茎、叶和长角果组织中未见表达， ZAP1的功能可能主要调控植株根和花的发生及形态建成。拟南芥MINI3（WRKY10）和 一种LRR激酶IKU2共同调控了种子的大小（Luo et al，2005）。 沙漠豆科植物Retama raetam的WRKY基因参与植物抗旱性建立和种子休眠的形成 （Pnueli et al，2002），而来源于灌丛(Larrea tridentata)的LtWRKY21蛋白质作为植物 激素

44、ABA信号转导途径的激活因子参与ABA介导的灌丛抗旱性建立 （Zou et al ， 2004） 。 有研究表明：WRKY转录因子参与植物胚胎发育等一系列生命活动。如Lagace等 （Lagace M， 2004）从自交不亲和的野生马铃薯胚珠中分离出一个型WRKY转录因子 ScWRKY1，其编码基因在茎和根中的表达水平很低，在发育的种子中几乎不表达，而 在叶中的表达水平很高，而且在受精后16天左右的鱼雷期胚胎中有瞬时高表达，表明 ScWRKY1转录因子在胚胎形成过程中起着重要的调节作用； Luo等 （Luo M et al ， 2005） 通过研究表明，转录因子WRKY10可能通过与IKU启动

45、子中的W-box结合从而调节IKU 基因的表达参与种子的发育过程。 1.3.4 WRKY转录因子在植物代谢中的作用 WRKY蛋白参与调节植物的一些代谢过程。赤霉素对调控植物种子萌发、植株生长 和花发育的信号转导途径建立具有十分重要的生理功能。 比如Zhang等 （Zhang Z L et al ， 2001；Xie Z et al，2006）通过研究发现水稻糊粉细胞中ABA诱导表达的转录因子 OsWRKY71可以通过与GA诱导转录激活因子OsGAMYB相互作用，并且另一个ABA诱 导表达转录因子OsWRKY51能通过与OsWRKY71相互作用从而提高OsWRKY71与 Amy32b启动子中W-

46、box的结合亲和力，从而阻断Amy32b启动子的活性，因此， OsWRKY71和OsWRKY51转录因子在水稻糊粉细胞GA信号转导过程中起抑制作用，而 它们很可能是ABA信号转导途径和GA信号转导途径的重要整合因子。 在部分与发育相关的基因中已经证实了WRKY结构域的存在。 一些WRKY基因调控 种子和胚形成：如参与种子萌发及萌发后生长的燕麦ABF1和ABF2(Rushton PJ et al， 1995)；参与豆科植物种子休眠（Puneli L et al，2005）；参与茄属植物（S.chacoense）平邑甜茶 MhWRKY15基因的克隆及表达分析 10 胚形成过程的ScWRKY1（La

47、gace M et al，2006）。有的WRKY基因控制植物生长发 育：如TTG2在表皮毛、种子内表皮以及根的无毛体整个发育时期表达，控制表皮毛的 早期发育、黏液的产生和鞣质合成（Johnson CS et al，2002；PU L et al，2004）； AtWRKY75受抑制后，导致侧根的数目和长度、根毛的数目变化、饥饿反应相关基因如 磷酸酶等以及与Pi 转运密切相关的基因表达受到抑制，证实它是WRKY家族中第一个 参与调控营养缺乏反应和根发育的成员（Devaiah B N et al，2007）。 在植物叶片衰老的信号转导途径建立方面WRKY基因也具有重要的调控作用。比 如，随着拟南

48、芥叶片衰老的发生，一组WRKY基因AtWRKY4、6、7、11、23等基因的 表达不断增强（Miao et al., 2004）。同时，在衰老叶片转录体中，就转录调控因子而言， WRKY转录调控因子的表达数量位居第二（Guo et al，2005）。Robatzek等（Robatzek S et al，2001）发现拟南芥AtWRKY6转录因子在幼片和成熟叶片几乎不表达，而在衰 老叶片中具有很高的表达水平，同时其表达水平不仅能调节相关防御基因如ELI3、PR1 和PR5的表达，还能调节衰老相关基因如SAG12和SAG13的表达，说明AtWRKY6转录因 子不仅与植物的防御应答有关，还与植物衰老程序密切相关；采用免疫沉淀分析表明， AtWRKY53蛋白可以和衰老相关基因家族（SAGs：senescenee-associated genes）特异结 合（ 如 SAG12基因）。进一步分析显示，在高表达AtWRKY53基因的转基因植株叶片内， SAG12基因的表达水平显著提高（Miao et al.，2004）。上述现象可能预示着WRKY基 因在植物叶片衰老的信号转导途径之中起着关键的调