茶树被茶尺蠖取食诱导的hpl基因克隆、功能鉴定与表达特征研究-吴义林.pdf

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1、安徽农业大学 硕士学位论文 茶树被茶尺蠖取食诱导的HPL基因克隆、功能鉴定与表达特征研 究 姓名：吴义林 申请学位级别：硕士 专业：遗传学 指导教师：韦朝领 2011-06 摘 要 C 6 挥发物是植物对害虫进行间接防御的关键物质之一，而植物体内的脂氢过氧 化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）是其合成的关键酶。而有关茶树 HPL基因 及其与害虫取食间的关系至今未见报道。 论文在本课题组前期建立的茶树被茶尺蠖取 食诱导前后的 cDNA 消减杂交文库（SSH）中获得一条与 HPL 同源性很高的 EST （GenBank：GW342656）基础上，对茶树 HPL基因进行了 c

2、DNA全长克隆、功能鉴 定、及其被茶尺蠖取食诱导的表达特征分析。主要结果如下： （1） 利用 3/5RACE 技术从茶树叶片中克隆了一条编码 HPL 的 cDNA 全长， 其序列长度为 1662 bp，从起始密码子开始有 5 个开放阅读框（ORF） ，其中最长的 ORF 编码含 491 个氨基酸的蛋白质，并命名为 CsHPL（GenBank：HM440156） ，其 理论分子量和 PI 分别为 54.88kD 和 8.02，多序列同源比对分析发现其与番石榴的 13HPL（AF239670）同源性最高，为 71%；蛋白质保守功能结构域预测分析表明， CsHPL 含有细胞色素 P450 家族中高度

3、保守的 4 个结构域 A、B、C 和 D，且结构域 A( I螺旋区)中保守的苏氨酸被异亮氨酸所代替，结构域 D中高度保守的半胱氨酸残 基附近有一些特殊的序列 NKQAA；进化树分析表明，CsHPL与番石榴的 13HPL等 同在一起属于 CYP74B亚类。 （2）原核表达分析表明，CsHPL基因表达的蛋白分布于上清和包涵体中，结果 产生了分子量约为60kD； 体外酶促反应结果显示， 原核表达的CsHPL只催化13HPOT 底物，而对 9HPOT不表现活性，因此属于 13HPL类型；原核表达的 CsHPL最适温 度为 25， 最适 pH值为 7.0。 对 CsHPL基因的 5个不同 ORF(Met

4、1, Met5, Met8, Met9 和 Met15)全部进行了原核表达，结果发现它们各自表达的蛋白都具有 HPL活性。 （3）利用 GCMS对原核表达的 CsHPL催化产物进行了鉴定，结果表明其将底 物 13HPOT催化生成的 C 6 挥发物为(z)3己烯醛。 （4）Southern blot 分析表明，CsHPL基因以单拷贝存在与茶树基因组中。 （5） qRTPCR分析表明，两个茶树品种龙井 43和舒茶早被茶尺蠖取食后 39 h， CsHPL 基因表达量能够明显上升，且达到最大表达量，随后下降，但是其最大表达 量和出现的时间存在品种间差异；龙井 43在取食后 3 h CsHPL基因表达量

5、上升至最 大值，为对照的 13.6倍，而舒茶早则在 9 h时表达量最大，为对照的 3.9倍。对两个 品种进行机械损伤后，CsHPL基因的表达呈现类似的规律。 关键词：茶树, 茶尺蠖, 脂氢过氧化物裂解酶, 基因克隆, 功能鉴定II Abstract C 6 V olatile is one of the key material which is indirect defense against pests in the plants, fatty acid hydroperoxide lyase is a key enzyme in its synthesis in plants. Howe

6、ver, it hasnt been reported that HPL gene of tea and the relationship between HPL gene and insect feeding. The EST fragment of hydroperoxide lyase (HPL) was screened form SSH library of tea induced by Ectropis oblique feeding. On this basis, research molecular cloning, functional identification and

7、expression characteristic of the HPL gene from Camillia sinesis induced by Ectropis oblique feeding. The main results are as follows: (1) A fulllength cDNA of HPL was first obtained by 3/5RACE (rapid amplification of cDNA ends) techniques from fresh leaves of Tea plant. The sequence length is 1662bp

8、. There are five open reading frame from the initiation codon. The longest ORF encode a polypeptide of 491 amino acid residues and named as CsHPL(GenBank：HM440156), theoretical molecular mass and PI of 54.88kD and 8.02, respective. The results showed that the sequence presented 71% similarity with t

9、he guava 13HPL genes by multiple sequence alignment analysis. CsHPL contains four highly conserved domains (domainA, B, C and D) of Cytochrome P450 family by conserved domain analysis. Its domain A (I helix) is isoleucine instead of conserved threonine. Its domain D has some specific sequences NKQAA

10、 in the vicinity of highly conserved cysteine residues. Phylogenetic analysis showed that CsHPL and guava 13HPL together are CYP74B subfamily. (2) Prokaryotic expression Analysis of the CsHPL gene resulted in the production of a special fusion protein which found in supernatant and inclusion body (M

11、W: about 60kD). In vitro enzymatic reaction showed that CsHPL of prokaryotic expression has activity when use 13HPOT as substrate and hasnt activity when use 9HPOT as substrate. Therefore, CsHPL is classified 13HPL. CsHPL of prokaryotic expression optimum pH is 7.0, optimum temperature is 25. Prokar

12、yotic expression of five different ORF of CsHPL gene, the results showed that the all special fusion protein has activity and significant about their active change. (3) V olatile substances of products was analyzed by GCMS, identified as (z)3hexenal when use 13HPOT as substrate. (4) Southern blot an

13、alysis, indicate that CsHPL is present as single copy in Tea plant genome. (5) qRTPCR analysis showed that two varieties of Longjing43 and ShuchazaoIII induced by Ectropis oblique feeding, the expression level of CsHPL gene can significantly increase on 39h, and attain maximum expression in this per

14、iod of time. However, the time of maximum expression is difference between Longjing43 and Shuchazao. After Longjing43 induced by Ectropis oblique feeding, the expression level of CsHPL gene increased to maximum on 3h which is 13.6 times compared with the control. However, the expression level of CsH

15、PL gene increased to maximum on 9h that is 3.9 times compared with the control. Mechanical damage of two varieties, the expression of CsHPL gene showed a similar rule. Keywords: Camellia sinensis, Ectropis oblique, hydroperoxide lyase, gene clone, Function identificationiii 图表清单 图 11 HPL的反应机制 图 12 脂

16、氢过氧化物裂解酶裂解途径 图 21 技术路线 图 41茶树叶片总 RNA琼脂糖凝胶电泳图 图 42 3/5RACE产物的电泳检测 图 43重组子菌落 PCR产物电泳检测 图 44全长序列扩增产物电泳检测 图 45重组子菌落 PCR产物电泳检测 图 46茶树中 HPL与其它植物中 HPL氨基酸序列比较 图 47 CsHPL系统进化树 图 48 CsHPL 的 Southern blot 分析 图 49 pET32a(+)/CsHPL重组载体双酶切电泳检测 图 410 重组载体 pET32a(+)/CsHPL 和空载体 pET32a(+)在大肠杆菌中诱导表达的 SDSPAGE分析 图 411不同温

17、度诱导后的 SDSPAGE分析 图 412各种处理下的吸光度变化 图 413 13HPOT浓度标准曲线 图 414 CsHPL活性的最适温度和最适 pH测定结果 图 415挥发性产物经 GCMS分析后结果 图 416 CsHPL基因定量 PCR标准曲线 图 417茶尺蠖取食和机械损伤诱导后 CsHPL基因的荧光定量分析结果 图 51不同植物中 HPL和 AOS血红素结合位点和 C末端的比较 图 52 13HPL的 N端序列比较 表 41 CsHPL 的 5个可能编码框的原核表达产物活性结果1 1文献综述 1.1 不同 HPL 的底物和产物特异性 根据底物特异性植物中 HPL可以被分为两类， 一

18、类裂解 13脂氢过氧化亚油 酸生成 12醛基(9Z) 十二碳烯酸和己醛，以及裂解 13脂氢过氧化亚麻酸生 成 12醛基(9Z) 十二碳烯酸和(3Z)己醛。另一类裂解 9过氧化亚油酸和 9脂氢 过氧化亚麻酸分别生成 9醛基壬酸和(3Z)壬烯醛或 9醛基壬酸和(3Z,6Z)壬二 烯醛。黄瓜果实和苗、大豆种子和幼苗以及紫花苜蓿苗中同时具有 9HPL 和 13HPL的催化功能 13 。西瓜幼苗、茶树叶片、番茄果实和叶片、苹果和青椒中 仅有 13HPL 的催化功能 48 。而梨中仅有 9HPL 的催化功能 9 。Matsui 等 10 ， 成功的从黄瓜苗中分离了 13HPL和 9HPL，表明不同的酶作用

19、于不同的特异底 物。然而，最近有一个黄瓜的 HPL被克隆出来，该 HPL可以作用于 2个不同的 底物 11 。该 HPL与 AOS的氨基酸序列相似性比与 13HPL的要高，它已经被归 于 CYP74C亚类。为了更好的了解 13HPL 和 9HPL之间的不同，应有一个特异 的 9HPL被分离和克隆。由于梨中只有 9HPL，因此它应该是最好的材料。 通过基因转变使底物脂氢过氧化脂肪酸中的羧基转变为甲酯或醇， 再用它作 为底物与茶树叶绿体和大豆中的 HPL 反应能大幅度减少其活性 1214 ，说明底物 的羧基对于 HPL的活性非常重要。相对的氢过氧化脂肪酸乙醇胺作为 HPL的底 物比氢过氧化脂肪酸更

20、好 15 。这暗示了底物首基的极性对于 HPL 的活性可能是 非常重要的，而首基的大小可能是不太重要。 底物中双键的位置和数目对植物中的 HPL 活性的影响也被研究了。茶树叶 片、番茄和青辣果实中 HPL作用于 13脂氢过氧化亚麻酸的活性比作用于 13 脂氢过氧化亚油酸的活性高了近 10倍 5,7,16 ，然而使亚油酸带有一个 15Z双键仅 能增加茶树叶绿体 HPL2%的活性 13 。增加一个 6Z(13氢过氧化(6Z,9Z,11E)亚 麻酸=13氢过氧化亚麻酸)双键可以强力的减少 HPL的活性 5,13,16 。 1.2 HPL的定位与调节 在西瓜苗中最高的 HPL活性表现在下胚轴和根的结合

21、处 4 ； 在黄瓜苗中它的 根是 HPL 活性的主要来源 17 。组织免疫印迹分析表明，辣椒果皮外面的实质细 胞中含有最多的 HPL 7 。这与它最初扮演的防御外界反应的角色相一致。此外， HPL 在植物中的定位似乎与细胞的快速增长与发育相连锁 1820 。同样，在地钱 目中当多态细胞处于对数生长期时该细胞中的 HPL 活性最高，当该细胞处于平 台期后，它的 HPL活性将急剧下降 21 。 虽然 HPL不包含清晰的跨膜区域，但 HPL被认为是膜蛋白 22 。它们的溶解 需要去污剂。一些植物来源的 HPL被定位于叶绿体 21,2327 或线粒体 5,28,29 。拟南 芥中的 HPL包含一条叶绿

22、体转运肽序列 30 ， 而番茄和紫花苜蓿中 HPL则没有该2 序列 22,31, 32 。因此， HPL在细胞内的定位仍不清楚，应进一步采用免疫细胞化学 法进行研究。 应对虫害和机械损伤 HPL的转录水平会有所增加，但该酶与 AOS不同，它 不能被茉莉酸甲酯处理所诱导 30,31 。创伤以后 HPL 产物的快速释放表明，在植 物中 HPL 已经存在不需要重新合成。该酶的底物通过创伤附近破碎的膜变的易 于接近该酶，从而激活该酶。在这种情况下，该酶应该是在膜上或者是被运输到 创伤位置。另一种可能是该酶是以原酶的形式存在，它通过去掉 N 末端的一段 序列而被激活。因为紫花苜蓿中 HPL 的 N 末端

23、开始的 22 个氨基酸序列被去除 以后，HPL的活性增加 22 。 1.3 HPL的结构特征 植物 HPL 属于细胞色素 P450(CytP450)类蛋白质家族，具有 CytP450 家族的 特征。CytP450酶素是包含血红素的单氧合酶，在所有的生物体中都存在。这个 超家族酶素起源于一个可能距今 3.510 9 年以前的祖先基因。 该蛋白质家族被命 名为细胞色素 P450 是由于该类酶被连二亚硫酸还原和用 CO 处理后，在 450nm 处有一特征的最大吸收峰 33 。到目前为止 CytP450酶素被认为是 6晶体结构，5 个可溶的原核 CytP450酶素和 1个真核微粒 P450酶素 343

24、6 。 分析晶体结构显示， P450 酶素在二级结构的基础上有一个三维模型。他们包括一个 螺旋区域 (4070%)和一个富含 折叠的区域(1022%)。活性位点血红素被高度保守的半胱 氨酸所束缚，位于蛋白内侧，在两个平行的环之间。这样就使它容易穿过疏水通 道。长的 I螺旋中高度保守的苏氨酸残基可能与氧结合和质子传递有关 34,3739 。 B螺旋和 F/G环结构是可调的，它们可能与不同底物结合和特异性有关 3537 。 问题在于，如果这个结构可以作为 CytP450 酶素的一般模型。CytP450 酶素 所有的 6 晶体三维结构是相似的，尽管它们的序列同一性很低，这说明所有的 CytP450酶

25、素可能有一个可以比较的结构 36,38 。 紫花苜蓿 HPL 的 CD光谱表明该 酶含有高比率的 螺旋，类似于 P450酶的晶体 40 。已知的 HPL的分子量与另外 一些 CytP450 酶素的相似。其活性位点的血红素基团经鉴定为血红素 b，这是 CytP450的又一特征 41 。 HPL也含有高度保守的半胱氨酸残基，该残基被认为是 起束缚血红素的作用 42 。有研究对该保守的半胱氨酸残基进行点突变实验，用 丙氨酸或丝氨酸残基代替半胱氨酸残基后使其活性散失且不含有血红素基团 40 。HPL 与 CO 亲和性较低，利用 CO 还原和处理后，大多数的 HPL 在 450nm 处没有最大吸收峰 3

26、2,41 。这一情况与 AOS 的相似，AOS 与 CO 的亲和性也比较 低 43 。因此这些酶在细胞色素 P450 家族中是比较独特的。HPL 与 AOS 一样， 不需要分子氧参与其活性反应。这些酶素与其它 P450 家族酶素同源性很低，I 螺旋区及氧结合穴中的保守苏氨酸残基的缺失，可能解释它们与 CO 的低亲和3 性。 1.4 活性位点 CytP450酶的辅基成分是原卟啉(血红素 b)。因此，可以用各种物理的方法 研究其活性中心的结构 44 。血红素铁位于原卟啉环的中心，由四个吡咯氮束缚。 大多数 CytP450酶的血红素结合区域含有一段特征序列 FxxGxxxCxxG,其中保守 半胱氨酸

27、残基的阴离子硫是作为血红素铁的第五配位体 34 。 大量的细胞色素 P450 是以低自旋状态存在，疏水底物和配体之间的相互作 用可以导致其由低自旋状态变为高自旋状态，但是已有人研究表明，处于低自旋 状态时是稳定的 45 。HPL 的自旋状态是随着温度的变化而变化的 40 。去污剂可 以诱导自旋平衡的变化(从低自旋到高自旋)，这与 I类型的相互作用相似 40 。去 污剂对于自旋状态的影响作用可能是 CYP74 家族酶素所特有的，因为在低自旋 的状态下，CytP450钝叶醇 14脱甲基酶(CYP51)能被 Triton X100溶解 46 。通 过对存在或缺失 Triton X100的 HPL进行

28、 EPR光谱分析表明， Triton X100可以 改变活性位点的构象 40 。一氧化氮合酶被大量的配体包裹可以看到上述相似的 现象 45 。因为在存在或缺失 Triton X100 的 HPL 的 CD 光谱是相等的，结构上 的变化显然是敏锐的 40 。 自旋状态的重要功能一直不被了解。有研究暗示高自旋形式是被快速的还 原，但是，这一还原几乎没有限速步骤。内皮的一氧化氮合酶自旋状态依靠与它 的来源，与其酶活性不相关 45 。相对的，除去 Triton X100使其自旋平衡发生变 化，从而引起 HPL 酶活性下降两倍 40 。与 HPL 相似，AOS 粗提物中加入去污 剂可使其活性增加两倍 2

29、,5,7 。因此可以推测， HPL的自旋状态对于其酶活性非常 重要。 有研究表明，HPL酶附近的膜组织可以调节其活性 7 。去污剂可能是模仿膜 环境，从而引起自旋状态的变化从低自旋到高自旋，进而使酶转变为高活性的构 想。甘油三酯能够诱导自旋状态的变化从低自旋到高自旋，从而证实了膜相似环 境的本质 40 。HPL 作为膜蛋白，当它的高自旋状态与其体内构象相联合后，可 能使其具有更高的活性。 1.5 反应机理 CytP450 酶素催化大量不同的反应如：羟基化反应，环氧化作用，N脱甲基 作用，去氨基反应，磺化氧化作用和脱硫作用等。大多数 CytP450酶素催化反应 时需要氧和 NAD(P)H等辅助因

30、子。 然而， HPL催化反应时不需要氧和 NAD(P)H 等辅助因子。 很长一段时间，人们认为植物 HPL 反应与异裂反应机制相似，因为 HPL 酶 催化反应生成的产物与异裂反应后的产物相似， 然而这一复杂的挥发产物同均裂4 获得的物质不一样。用 18 O标记的底物进行研究，观察到氢化氧化物中的 18 O没 有被转移到己醛中，而被转到 12醛基(9Z) 十二碳烯酸 47 。根据这一结果， Hatanaka 等 16 ，提出了一个异裂机理。HPL 催化反应与过氧化支路类似，推测 该反应是通过均裂过氧氢基团开始，利用该基团的清除剂可以抑制酶活性，从而 支持上述推测 48 。此为，二硫苏糖醇和 13

31、羟基亚油酸能够防止 13HPL 酶的失 活，表明酶的失活是由于邻近 HPL反应中心的 SH关键基团的破坏所引起 49 。 根据已知的 CytP450酶素的化学作用机制， Noordermeer等首先提出了 HPL可能 的反应机理。他们认为第一步反应机理是均裂脂氢过氧化物过氧基中的氧氧键， 从而产生烷氧基和铁羟络合物。 有人认为铁卟啉和脂氢过氧化物相互作用直接生 成铁羟基络合物 50,51 。 HPL下一步的反应机理是铁羟络合物给予氢氧化物离子一 个质子，并从烷氧基中吸收一个电子，从而生成了烯丙基醚阳离子中间产物。 Hatanaka 等 52 研究表明，在 HPL 的异裂机理中存在一个烯丙基醚阳

32、离子中间产 物。最后，碳阳离子加水重排生成 C 6 醛和 C 12 烯醇，而 C 12 烯醇在经过酮烯醇 互变异构作用产生 w含氧酸 42 (图 11)。 图 11 HPL的反应机制 Fig.11 Reaction mechanism of HPL5 1.6 HPL在植物害虫取食防御中的作用机理及其研究现状 植物在与植食性昆虫漫长的协同进化过程中， 已形成了多种多样的防御机制 来抵抗昆虫的危害。这些防御机制可被归纳为两类：组成性防御和诱导性防御。 组成性防御是指植物受害之前就固有的能够抵抗昆虫危害的物理的和化学的障 碍，而诱导性防御是指当植物受害时才被激活的防御机制。现已证明，植物体内 存在着

33、 2种诱导性防御：直接防御和间接防御。直接防御是指植物自身具有的能 够影响寄生植物感虫性的任何一种特性。 间接防御是指通过释放挥发性化合物吸 引天敌昆虫，并以此控制植食性昆虫。LOX 途径是植物中一条重要的间接防御 途径，脂氢过氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）是 LOX/HPL途径中的 关键酶， 裂解 LOX的反应产物 （脂氢过氧化物） 生成绿叶性气味物质 （green leafy volatiles, GLVs,包括含 6个碳的醛、醇和脂）和含氧酸 22 (图 12)。现在对于植物 间接防御反应中的 LOX/AOS途径即茉莉酸途径的反应机制及作用研究的比较透 彻

34、， 但对于同一系统下的 LOX/HPL途径在植物防御反应中所起作用的研究较少。 LOX/HPL 途径在植物抗虫反应中所起作用最近引起了国内外人士的关注 5356 。 Mescher等 54 发现，烟草被烟芽夜蛾取食后释放的 GLVs对烟芽夜蛾成虫的产卵 有驱避作用。Baldwin 等 55 研究发现，烟草天蛾取食烟草叶片后可使烟草释放 (Z)3己烯醇，该挥发性物质可以引诱烟草天蛾的天敌从而起到抗虫作用。植物 被昆虫取食后， GLVs等成分的释放量增加， GLVs是植物防御基因的信号分子 1 ， 可以诱导植物相关防御基因的表达 5760 。有研究表明，昆虫取食菜豆所释放的 GLVs 能够诱导附近

35、健康的菜豆防御相关基因 PR2 和 PR3 等的表达 57,58 ；Bate 等 59 研究发现， 己烯醛可以诱导拟南芥叶片中 CHS和 HMGR等相关防御基因的 表达。此外，GLVs 还能诱导棉花产生抗菌物质 61 。有研究证实，13HPOD 被 13HPL 裂解生产的 C 12 产物（愈伤素）可以作为伤口愈合反应的信号分子，诱 导伤口附近细胞快速增长，且与植物创伤应激反应相关 22,31 。6 图 12 脂氢过氧化物裂解酶裂解途径 Fig .12 Cracking way of hydroperoxide lyase7 2 引 言 2.1 研究意义与目的 我国产茶区气候温暖潮湿，虫害是茶树

36、较常见的一种自然灾害。据调查，在 我国茶区中已发现茶树虫害 400 多种，其中常见的有 40 多种，多为鳞翅目、同 翅目及鞘翅目昆虫，茶尺蠖是茶树主要害虫之一。茶树虫害成为茶叶高产优质的 一个重要限制因素，长期以来，我国茶农主要使用化学农药防治茶树害虫，然而 化学农药的大量使用引起一系列的副作用，害虫天敌被杀灭、生态平衡被破坏， 自然界和茶叶中残毒增加、环境被污染。因此,如何提高茶树自身的抗虫性,已引 起人们的高度重视。 植物本身对害虫的取食就存在重要的诱导防御，其包括直接防御和间接防 御，从进化角度来说，植物采用对害虫采用间接防御系统最为经济，也最常见和 有效，因此正成为当今研究的热点。在植

37、物体内，C 6 挥发物是重要的间接防御 害虫的次生挥发物，而脂氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase，HPL)是其合成 的关键酶。已有研究证明 HPL 广泛的分布于植物中，它的催化产物不仅是植物 特异气味的主要成分之一，而且与植物抗病、抗虫有关，且在植物虫害防御中的 作用成为关注的重点。 自 1996 年首先从辣椒中得到了 HPL 的 cDNA 全长序列 42 后，人们相继从 青椒、黄瓜、甜瓜、拟南芥、番茄、番石榴和柑橘等多种植物中得到了 HPL 的 cDNA 11,6267 ，但是大多集中在草本植物，而木本植物的相关研究甚少；更为重 要的是目前有关茶树的 HPL 基因信息未

38、见报道，茶树对害虫取食的间接防御功 能研究尚处于起步阶段。因此本论文从茶树中克隆 HPL 基因的 cDNA 全长，并 对其进行基因特征和功能鉴定，及其在茶尺蠖取食诱导后的表达特征分析，为进 一步研究茶树自身对害虫取食诱导的间接防御、 茶树抗虫品种筛选和内源抗虫基 因的发掘具有重要的理论和实践指导意义。 2.2 研究内容 (1) 根据课题组前期从茶尺蠖取食诱导下茶树的 SSH 文库中所获的与植物 HPL 基因同源性很高的 EST，通过 3/5RACE技术获得茶树 HPL基因的 cDNA 全长序列。 (2) 利用 GenBank 数据库中的 BLAST、DNAMAN 软件和 MEGA软件对茶树基

39、因的 cDNA序列进行同源比对分析、功能结构域预测，以及进化树分析。 (3) 通过 Southern blot 实验，分析 CsHPL基因在茶树基因组中的拷贝数。 (4) 利用原核表达系统，对获得茶树 HPL 基因的可能 ORF 进行体外表达、酶活 测定、催化底物类型的确定。 (5) 以 GCMS鉴定原核表达的 CsHPL催化产物。8 (6) 以 qRTPCR分析茶树被茶尺蠖取食与机械损伤后， CsHPL基因的表达特征。 2.3 技术路线 图 21 技术路线 Fig.21 Technical route9 3 材料与方法 3.1 实验材料与处理 3.1.1实验材料 茶 苗：用于试验的茶树品种为

40、国家无性系良种龙井 43 和舒茶早。茶苗选 自安徽省舒城县九一六茶场苗圃的盆栽 2年生扦插苗。 茶尺蠖：幼虫采自安徽潜山茶场，并在实验室进行保存饲养。 其 它：克隆菌株 DH5和表达菌株 Rosetta (DE3 )均为本实验室保存；实 验所需引物的合成及 PCR产物的测序工作由 Invitrogen公司完成。 3.1.2 试验处理 实验前选取长势均匀一致且完好无损的茶苗，按照同一标准进行肥水管理， 待茶树生长稳定后进行后续试验。 处理前， 选择长势均匀一致的茶苗若干盆备用。 害虫取食处理：取 4 龄茶尺蠖幼虫释放到茶苗上，每株释放 10 头幼虫，待 有约 1/3的叶片受损后，将幼虫全部移走。

41、以未取食的完好植株为对照。 机械损伤处理：按照茶尺蠖取食叶片的习惯，用灭菌后的洁净剪刀沿着主脉 方向按照残留叶片受损形状进行剪切， 每株被剪叶位和剪掉的叶面积与茶尺蠖取 食的差不多。以完好植株为对照。 在害虫取食或机械损伤处理后 3h、6h、9h、12h和 24h分别采样，采集的样 品迅速放入液氮中速冻，后放入80冰箱储存备用。 3.2 仪器与试剂 3.2.1 主要实验仪器 PCR仪 英国 HYBAID公司，德国 Biometra公司 恒温振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司 电热恒温鼓风培养箱 上海精宏实验设备有限公司 超低温冰箱 日本三洋公司 超净工作台 苏州净化设备有限公司 Dark r

42、eader荧光透射仪 Clare Chemical Research公司 核酸定量仪 Thermo 公司 凝胶成像系统 BioRad公司 TS2000脱色摇床 北京市新科技应用研究所 超声波细胞粉碎机 宁波新芝科器研究所 低速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司 高速冷冻离心机 Beckman公司，Eppendorf公司 半干转膜槽 BioRad公司 Power PAC 3000电泳仪 BioRad公司10 7200型分光光度计 上海天美科学仪器仪器有限公司 3.2.2 主要试剂 Clontech公司： RACE试剂盒 TaKaRa公司产品： Taq酶、LA Taq、高保真酶、DNA纯化回收

43、试剂盒、 pMD18T Simple Vector、 T4DNA连接酶、 BamH I和 HindIII核酸内切酶 Axygen公司产品： 质粒提取试剂盒、 DNA Marker、 低分子量蛋白 Marker Amresco 公司产品： 丙烯酰胺、TEMED 3.2.3 实验中常用试剂配方 诱导表达试剂 (1) LB液态培养基：蛋白胨 1g，酵母粉 1g，NaCl 0.5g，ddH 2 O定容至 100mL. (2) 1mol/L IPTG：在 8mL蒸馏水中溶解 2.383g IPTG后，用蒸馏水定容至 10mL， 用 0.22m滤器过滤除菌，分装成 0.2 mL小份贮存于20. SDSPA

44、GE主要试剂 (1) 40%丙烯酰胺N,N亚甲双丙烯酰胺：丙烯酰胺 18.75g， N， N亚甲双丙烯酰 胺 0.5g，ddH 2 O定容至 50mL. (2) 4浓缩胶缓冲液(pH=6.8)：Tris 6.05g，用浓 HCl调 pH至 6.8，ddH 2 O定容至 100mL，4保存。 (3) 4分离胶缓冲液(pH=8.8)：Tris 18.15g，用浓 HCl调 pH 至 8.8，ddH 2 O定容 至 100mL，4保存。 (4) 10%过硫酸铵溶液：过硫酸铵 0.1g，ddH 2 O定容至 1mL，4保存。 (5) 20% TEMED （N,N,N,N四甲基乙二胺） ： TEMED

45、0.2mL， 双蒸水 0.8mL， 4 保存。 (6) 0.1%溴酚蓝：溴酚蓝 0.1g，双蒸水 100mL，4保存。 (7) 5loading buffer：Tris（pH6.8）1.2mL，甘油 2.5mL，SDS 0.2g，巯基乙醇 0.5mL，溴酚蓝 10mg，加 ddH 2 O定容至 10mL，20保存。 (8) 电泳缓冲液：Tris 1.5g，Glycine 7.2g，SDS 0.5g，ddH 2 O定容至 500mL. (9) 染色液：考马斯亮蓝 R250 0.25g，甲醇 227mL，冰醋酸 46mL，ddH 2 O定容 至 500mL. (10) 脱色液：乙醇 75mL，冰醋

46、酸 50mL，ddH 2 O定容至 1000mL. 3.3 实验方法 3.3.1总 RNA的提取和检测 3.3.1.1 茶树叶片总 RNA的提取 参照史成颖等 68 的改良 CTABLiCl法提取茶树叶片的总 RNA，具体方法如11 下： (1) 在预冷的 2mL 离心管中加入 0.9mL65预热的 CTAB 提取缓冲液 (2%CTAB, 100mmol/L TrisHCl pH8.0, 1.4mol/L NaCl, l20mmol/L EDTA pH 8.0)和 5%巯基乙醇。 (2) 在预冷研钵中加入不溶性 PVPP(w/w 10%)，称取龙井 43嫩叶(一芽二叶)0.4g 迅速放入其中，再加液态氮迅速研磨成粉末状，立刻转移到上述 2ml离心管 中。涡旋混匀后，65水浴 2030min。 (3) 每管加入 0.9mL 氯仿/异戊醇(24:1),上下颠倒混匀, 冰浴 10min , 4条件下 12 000g离心 10m