常用的分子生物学技术原理及应用ppt课件.ppt

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1、2022-6-21Suzhou University1常用分子生物学技术的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and ApplicationApplication2022-6-21Suzhou University2第第 一一 节节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & BlottingMolecular Hybridization & Blotting Technol

2、ogyTechnology2022-6-21Suzhou University3定义：核酸分子杂交定义：核酸分子杂交 (nucleic acid ybridization ) (nucleic acid ybridization ) 在在DNADNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNADNA单链分子单链分子放在同一溶液中，或把放在同一溶液中，或把DNADNA与与RNARNA放在一起，只要放在一起，只要在在DNADNA或或RNARNA的单链分子之间有一定的碱基配对关的单链分子之间有一定的碱基配对关系 ， 就 可 以 在 不 同 的 分 子 之 间 形 成 杂 化 双 链系 ， 就

3、可 以 在 不 同 的 分 子 之 间 形 成 杂 化 双 链(heteroduplex) (heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理2022-6-21Suzhou University4复性复性RNADNA2022-6-21Suzhou University5（一）印渍技术（一）印渍技术 Blotting Blotting 首先由Edwen Southern在1975年提出。Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质，并加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA和蛋白质的检测. 2022-6-21Suz

4、hou University6（二）探针技术 probe 将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。2022-6-21Suzhou University71、探针的制备方法、探针的制备方法探针长度一般以探针长度一般以50300bp为宜。为宜。制备方法：制备方法：1）利用）利用DNA重组技术重组技术2）PCR扩增扩增3）化学合成）化学合成2022-6-21Suzhou University82、探针的分类：、探针的分类： 据制备方法及核酸性质不同，可分为：据制

5、备方法及核酸性质不同，可分为：（1）基因组）基因组DNA探针探针（2）cDNA探针探针（3）RNA探针探针（4）寡核苷酸探针）寡核苷酸探针2022-6-21Suzhou University93、合成寡核苷酸探针注意原则：、合成寡核苷酸探针注意原则：1 1）长度（）长度（10-50 10-50 bp); bp); 2) G:C2) G:C对含量对含量40%-60%40%-60%；3 3）探针内避免互补；）探针内避免互补；4 4）避免同一碱基连续出现；）避免同一碱基连续出现；5 5）与非靶序列有）与非靶序列有70%70%以上同源性或连续以上同源性或连续8 8个个以上碱基序列相同，最好不用。以上碱

6、基序列相同，最好不用。Home2022-6-21Suzhou University104、核酸探针的标记、核酸探针的标记 为确定探针是否与相应基因组为确定探针是否与相应基因组DNADNA杂交，有必要对探针加以标记，以杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。便在结合部位获得可识别的信号。2022-6-21Suzhou University11（1 1）标记的种类）标记的种类同位素：同位素： 32 32P P、3535S S、3 3H H、125125I I等标记探针等标记探针非同位素：非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物两者

7、比较：后者不及前者敏感，但后者保存两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。时间较长，无同位素污染。2022-6-21Suzhou University122022-6-21Suzhou University13（3）一个理想的标记物：1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同标记前后探针的基本结构、化学性质相同; ;2 2）特异性强、本底低、重复性好；）特异性强、本底低、重复性好；3 3）操作简单、节时；）操作简单、节时；4 4）安全、无环境污染。）安全、无环境污染。2022-6-21Suzhou University14（4）探针的标记方法）探针的标记方法1 1）缺口平移

8、法）缺口平移法2 2）随机引物标记法）随机引物标记法3 3）末端标记法）末端标记法4 4）生物素光照标记法）生物素光照标记法2022-6-21Suzhou University15Nick TranslationOHpOH+PPDNAdNTP ，DNA酶酶I，DNA聚合酶聚合酶I32P-dNTP Bio-dNTP2022-6-21Suzhou University16随机引物标记探针53553DNA32p-dNTP,Bio-dNTP6bp primerKlenow,dNTP变性变性-复姓复姓2022-6-21Suzhou University173、DNA末端标记末端标记2022-6-21Su

9、zhou University18（三）印渍技术的类别及应用（三）印渍技术的类别及应用 DNADNA印迹技术印迹技术 Southern blottingSouthern blottingRNARNA印迹技术印迹技术 Northern blottingNorthern blotting蛋白质印迹技术蛋白质印迹技术 Western blotting Western blotting 斑点印迹斑点印迹 Dot blottingDot blotting原位杂交原位杂交 in situ hybridization in situ hybridization DNADNA点阵点阵 DNA array DN

10、A array DNADNA芯片技术芯片技术 DNA chip DNA chip 2022-6-21Suzhou University191 1、DNADNA印迹技术印迹技术 Southern blottingSouthern blotting （1 1）定义：）定义：又称为又称为SouthernSouthern杂交，即杂交，即DNA-DNADNA-DNA杂交分析。是杂交分析。是研究研究DNADNA图谱的基本技术，主要用于基因组图谱的基本技术，主要用于基因组DNADNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。亦可用于

11、分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断在遗传诊断DNADNA图谱分析及图谱分析及PCRPCR产物分析等方面有重要价值。产物分析等方面有重要价值。2022-6-21Suzhou University202 2、基本方法、基本方法 将将DNADNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；凝胶电泳分离各酶解片段； 经碱变性，经碱变性，TrisTris缓冲液中和，高盐下通过毛吸缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将作用将DNADNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中烘干固定，凝胶中DNADNA片段的相对位置在片段的

12、相对位置在DNADNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。片段转移到滤膜的过程中继续保持着。 附着在滤膜上的附着在滤膜上的DNADNA与与3232P P标记的探针杂交，利标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条用放射自显影术确定探针互补的每条DNADNA带的带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的的DNADNA片段的位置和大小。片段的位置和大小。2022-6-21Suzhou University21Paper TowelsSouthern BlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿无水乙醇离心2022-6-21Suzhou Uni

13、versity22。2022-6-21Suzhou University23真空转膜槽真空转膜槽滤纸滤纸尼龙膜尼龙膜凝胶凝胶盖子盖子+-真空转膜真空转膜2022-6-21Suzhou University242022-6-21Suzhou University252022-6-21Suzhou University26（2 2）RNARNA印渍技术印渍技术 Northern blottingNorthern blotting 又称为又称为NorthernNorthern杂交，即杂交，即RNA-DNARNA-DNA杂交分析。杂交分析。是一种将是一种将RNARNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素从琼

14、脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。膜上的方法。 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNAmRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。一基因的表达情况。2022-6-21Suzhou University27（3 3）蛋白质印渍技术）蛋白质印渍技术Western blottingWestern blotting 又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分

15、子的相互作用研究等。 2022-6-21Suzhou University28Western Blot 2022-6-21Suzhou University292022-6-21Suzhou University30三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较2022-6-21Suzhou University31DNADNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting)(Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNADNA、重组质粒和噬菌体的、重组质粒和噬菌体的分析。分析。RNARNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting)(Northern blotti

16、ng) 用于用于RNARNA的定性定量分析。的定性定量分析。蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析 (Western blotting)(Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。2022-6-21Suzhou University32（4 4）斑点印迹）斑点印迹 Dot blottingDot blotting斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个

17、样品。膜上可同时检测多个样品。 2022-6-21Suzhou University33DNA 样品样品 点样点样Probe-32P检测检测AB1 2 3 42022-6-21Suzhou University34（5 5）原位杂交）原位杂交 in situ hybridizationin situ hybridization即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。2022-6-21Suzhou University35第二

18、节 生物芯片（biochip）方法方法2022-6-21Suzhou University36一、定义一、定义 指采用光导原位合成或微量点样等方法，指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分

19、析，从而判断样品中靶分子的地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。数量。2022-6-21Suzhou University37二、生物芯片的种类DNA芯片：又称DNA芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。蛋白质芯片：利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。 其它芯片：2022-6-21Suzhou University38三、发展过程2022-6-21Suzhou University39四、芯片的制备四、芯片的制备 （一）支持

20、物的预处理（一）支持物的预处理1、实性材料：、实性材料：硅芯片、玻片和瓷片硅芯片、玻片和瓷片 需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。基活性基团。2、膜性材料：、膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维 膜，膜，通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸2022-6-21Suzhou University40(二) 芯片制备方法 （1 1）原位合成（）原位合成（in situ synthesisin situ synthesis） 光导原位合成法光导原位合成法 原位喷印合成原位喷印合成 分子印章多次压印合成分子印章

21、多次压印合成 （2 2）点样法）点样法2022-6-21Suzhou University41 原位合成原位合成(In Situ Synthesis)2022-6-21Suzhou University42合成后交联合成后交联方式方式：预先合成：预先合成DNA或制备基因探针然或制备基因探针然后打印到芯片上后打印到芯片上探针的制备：探针的制备：已克隆的基因片段已克隆的基因片段PCR，RT-PCR扩增的基因片段扩增的基因片段人工合成的人工合成的DNA片段片段单链、双链、单链、双链、DNA或或RNA 均可作为探针均可作为探针2022-6-21Suzhou University43五、样品的准备五、样

22、品的准备样品的分离纯化样品的分离纯化DNA , mRNA扩增扩增PCR, RTPCR，固相，固相PCR标记等过程标记等过程荧光标记（常用荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射），生物素、放射性标记性标记2022-6-21Suzhou University44六、分子杂交六、分子杂交样品与样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。芯片上的探针阵列进行杂交。与经典分子杂交的区别：与经典分子杂交的区别：1. 杂交时间短，杂交时间短，30分钟内完成分钟内完成2. 可同时平行检测许多基因序列可同时平行检测许多基因序列影响杂交反应的因素：影响杂交反应的因素：盐浓度、温度、反应时间、盐浓度、温度、反应时间

23、、DNA二级结构二级结构2022-6-21Suzhou University45肽核酸肽核酸( peptide nucleic acid , PNA)是一类以氨基酸替代糖是一类以氨基酸替代糖-磷磷酸主链的酸主链的DNA类似物，骨架由重复的类似物，骨架由重复的N-甘氨酸通过酰胺键相连构成，碱基甘氨酸通过酰胺键相连构成，碱基则通过甲叉碳酰基与骨架相连。则通过甲叉碳酰基与骨架相连。1. PNA分子内不会形成二级、三级结构分子内不会形成二级、三级结构2. DNA与与PNA杂交不需要盐离子杂交不需要盐离子2022-6-21Suzhou University46七、检测分析七、检测分析1. 激光激发使含荧

24、光标记的激光激发使含荧光标记的DNA片段发片段发射荧光射荧光2. 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号各杂交点的信号3. 软件进行进行图象分析和数据处理软件进行进行图象分析和数据处理2022-6-21Suzhou University47 2022-6-21Suzhou University48DNA测序测序；杂交测序（；杂交测序（SBH）基因表达分析基因表达分析：基因组研究基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析因功能分析基因诊断基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因：寻找和检测与疾病相关的基因及在及在RNA水平上检测致

25、病基因的表达水平上检测致病基因的表达药物研究与开发药物研究与开发：2022-6-21Suzhou University49cDNA microarray expression patterns of small (S) and large (L) neurons2022-6-21Suzhou University50基因表达谱（基因表达谱（gene expression pattern)红色红色 上调上调黄色黄色 不变不变绿色绿色 下调下调2022-6-21Suzhou University51基因芯片的优点基因芯片的优点：1. 高通量高通量2. 大规模大规模3. 高度平行性高度平行性4. 快

26、速高效快速高效5. 高灵敏度高灵敏度6. 高度自动化高度自动化2022-6-21Suzhou University52第三节第三节 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction2022-6-21Suzhou University53PCRPCR技术技术 polymerase chain polymerase chain reactionreactionPCRPCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐即聚合酶链反应技术，是指利用耐热热DNADNA聚合酶的反复作用，通过变性聚合酶的反复作用，通过变性- -延伸延伸-

27、 -复性的循环操作，在体外迅速将复性的循环操作，在体外迅速将DNADNA模板模板扩增数百万倍的一种操作技术。扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在理论上可在2 2小时内将一个小时内将一个DNADNA分子扩分子扩增到增到10106 6-10-109 9倍，从而大大提高对其进行分析倍，从而大大提高对其进行分析研究的速度。研究的速度。 2022-6-21Suzhou University542022-6-21Suzhou University55PCRStep1 变性变性Step2 退火退火2022-6-21Suzhou University56ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCAT

28、CAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3 : Extension 延伸72CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaq PolymeraseTaq PolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA2022-6-21Suzhou Universit

29、y57一、原一、原 理：理：1) 合成待扩增区域两端已知序列，与模板合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；段的长度；2) 反应体系：反应体系：DNA模板，模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，聚合酶，buffer3) 反应程序：反应程序： 变性变性 ( 9495oC) 复性复性 延伸延伸 ( 3755 oC) ( 7072 oC ) 72 oC延伸延伸10min 30-35cycles DNA扩增扩增100万倍万倍2022-6-21Suzhou University58PCR扩增2022-6

30、-21Suzhou University59n模板模板DNADNAn特异性引物特异性引物n耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶ndNTPsdNTPsnMgMg2+2+ 二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分2022-6-21Suzhou University601、引物设计原则、引物设计原则1 1）引物的特异性）引物的特异性 2 2）避开产物的二级结构区）避开产物的二级结构区 3 3）长度）长度寡核苷酸引物长度为寡核苷酸引物长度为15301530bpbp，一般为一般为20272027mermer。 4 4）G+CG+C含量含量一般为一般为40%60%40%60%。Tm=4Tm=4（G

31、+CG+C）+2+2（A+TA+T）5 5）碱基础随机分布：）碱基础随机分布：33端不应超过端不应超过3 3个连续的个连续的G G或或C C 6 6）引物自身，引物之间无二级结构）引物自身，引物之间无二级结构8 8）引物的）引物的33端：不可以修饰端：不可以修饰 9 9）引物的）引物的55端：可以被修饰，包括：加酶切位点；标记端：可以被修饰，包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛。生物素、荧光、地高辛。1010）密码子的简并）密码子的简并2022-6-21Suzhou University612、Taq酶普通普通Taq酶酶Pfu Taq酶酶PfuPfu能纠正能纠正DNADNA扩增（扩增（P

32、CRPCR）过程中产生过程中产生的错误，而传统的的错误，而传统的Taq DNA Polymerase, Tth DNA Taq DNA Polymerase, Tth DNA Polymerase Polymerase 及它们的突变体如及它们的突变体如AmpliTaq, KlenTaqAmpliTaq, KlenTaq等等都不能。它比都不能。它比Taq DNA PolymeraseTaq DNA Polymerase及突变体低及突变体低1010倍，倍，比比Vent Vent 和和PwoPwo低低2-42-4倍，比倍，比UlTmaUlTma低低3030倍。倍。 Kod Taq酶酶是是toyobo

33、公司专利产公司专利产品，品，世界最高保世界最高保真水平的真水平的PCR酶酶。长片段长片段Taq酶酶2022-6-21Suzhou University62三、三、PCRPCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C如何确定如何确定PCRPCR循循环参数？环参数？2022-6-21Suzhou University63四、PCR的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆 PCRPCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：有： 与反转录反应相结

34、合，直接从组织和细胞的与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA mRNA 获得已知目的基因片段；获得已知目的基因片段； 利用特异性引物以利用特异性引物以cDNAcDNA或基因组或基因组DNADNA为模板，为模板，获得已知的目的基因；获得已知的目的基因； 利用简并引物从利用简并引物从cDNAcDNA文库或基因组文库中获得文库或基因组文库中获得具有同源性的具有同源性的DNADNA片段；片段； 利用随机引物从利用随机引物从cDNAcDNA文库或基因组文库中随机文库或基因组文库中随机获得目的基因。获得目的基因。 2022-6-21Suzhou University64（二）基因的体外突变（二）基

35、因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。失、点突变等改造。（三）（三）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析 由于由于PCRPCR技术具有高度敏感性，故可用于微量技术具有高度敏感性，故可用于微量DNADNA和和RNARNA的分析检测。的分析检测。 （四）（四）DNADNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析2022-6-21Suzhou University65PCRPCR特点及应用特点及应用：优点：优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；（2

36、）微量的模板）微量的模板DNA即可扩增大量产物。即可扩增大量产物。应用：应用：（1）基因组）基因组DNA分析；分析；（2）遗传物质的鉴定；）遗传物质的鉴定；（3）遗传病的诊断。）遗传病的诊断。缺点：缺点：（1）需靶）需靶DNA序列的信息；序列的信息； （2）产物短小，）产物短小，DNA复制不精确。复制不精确。2022-6-21Suzhou University66五、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录（一）反转录PCRPCR技术技术（二）反向（二）反向PCRPCR（三）三）RAPD PCRRAPD PCR（四（四）原位原位PCRPCR技术技术（五）实时（五）实时PCRPCR技术技术2022-

37、6-21Suzhou University67PCR相关技术：相关技术： 1）增效）增效PCR（booster PCR） 当扩增少于当扩增少于1000拷贝的模板拷贝的模板DNA时会遇时会遇到两个问题：到两个问题： 一是形成引物二聚体，一是非特异扩增一是形成引物二聚体，一是非特异扩增.消消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。 对于这种情况，可设置二步对于这种情况，可设置二步PCRPCR，先用较低浓度先用较低浓度的引物进行初级的引物进行初级PCRPCR，此时由于引物少，形成产物二此时由于引物少，形成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只聚体的可能

38、减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经是由于引物少产量不高。约经15201520个循环后补充引个循环后补充引物量，以初级物量，以初级PCRPCR产物为模板进行扩增，靶序列的产产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。量将相应增加。2022-6-21Suzhou University682)巢式巢式PCR（nest PCR） 此时也是进行二步此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第与上面不同的是，第二级二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，引物的内侧，用初

39、级用初级PCR产物做模板，进行第二步产物做模板，进行第二步PCR，这样只这样只有初级有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。终产物的特异性。2022-6-21Suzhou University69 在同一在同一PCR体系中加入若干对体系中加入若干对PCR引物，引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个同时扩增多个DNA片段。片段。 多重多重PCR

40、常用来检测同一基因的多个外常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。2022-6-21Suzhou University704）RT-PCR RT-PCR是以是以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录酶作用合成录酶作用合成cDNA。使微量的使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达水平）迅速扩增（达ngg水平），大大提高水平），大大提高mRNA的检的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。研究。2022-6-21Suzhou University71RT-PCR需注意RACE技术2022-6-21Suzhou

41、 University72RT-PCRcDNA2022-6-21Suzhou University735）单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP） 是指单链是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成这种差异将造成相同或相近长度相同或相近长度的单链的单链DNA电泳电泳迁移率不同。据此，可用于迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。代，微小的缺失或插入的检测。 通常与通常与PCR技术联合应用，称为技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。

42、技术。 在疑有突变的在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的突变所引起的DNA构构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。2022-6-21Suzhou University742022-6-21Suzhou University756）差异展示反转录差异展示反转录PCR (differential display reverse transcriptase PCR ，D

43、DRT-PCR)Liang P.Liang P. (1992)(1992)建立此法，建立此法，用来分离变异用来分离变异细胞中的特异细胞中的特异RNARNA，它可用来由少量它可用来由少量mRNAmRNA产产生生cDNA,cDNA,以鉴别细胞间的表达差异。以鉴别细胞间的表达差异。DDRT-PCRDDRT-PCR的关键是采用经修饰的寡聚的关键是采用经修饰的寡聚dTdT；引物用于反转录，即引物用于反转录，即polyA+mRNA polyA+mRNA 在引物的在引物的33端的双核苷酸的差异退火端的双核苷酸的差异退火 。 2022-6-21Suzhou University76 5 GC(A)n 5 GC

44、(A)n 5 CC (A)n RTase +d(T)nGC primer 3 CTGA CGTTT 3 TCTG CGTTT 32P-dATP.d (T)nGC +GATC +AGAC TCTG CTGA GACT AGAC CTGA TCTG2022-6-21Suzhou University77 用固醇处理 PCG 放射自显影 Northern blot 处理时间 0 2 8 16 DD1 DD2 DD1 DD3 对照 DD4切下电泳带，PCR 扩增，并进行 Northernblot2022-6-21Suzhou University78 5 调控区 前导区 编码区 3 拖尾序列 RE R

45、E 连接酶封闭反向PCR2022-6-21Suzhou University797 7）实时）实时PCRPCR技术原理技术原理2022-6-21Suzhou University80第第 三三 节节核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic Acid Sequence AnalysisNucleic Acid Sequence Analysis2022-6-21Suzhou University81核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert(Maxam-Gillbert法法) )DNADNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (Sa

46、nger(Sanger法法) )2022-6-21Suzhou University82一、化学裂解法一、化学裂解法(Maxam-Gilbert(Maxam-Gilbert法法) )基本原理基本原理基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNADNA链在链在1 1个或个或2 2个个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的的DNADNA片段，将这些片段经电泳分离。片段，将这些片段经

47、电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNADNA的的5 5 末端，经放末端，经放射自显影即可在射自显影即可在X X胶片上读出胶片上读出DNADNA链的序列。链的序列。2022-6-21Suzhou University83 化学裂解法的示意图化学裂解法的示意图2022-6-21Suzhou University84二、二、DNADNA链末端合成终止法链末端合成终止法2022-6-21Suzhou University85目目 录录2022-6-21Suzhou University86三、三、DNADNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现采用荧光替代放射性核素标记是

48、实现DNADNA序序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行双脱氧核苷酸，然后进行SangerSanger测序反应，反应测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小通过四种激光激发不同大小DNADNA片段上的荧光分片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定光信号，并依此确定DNADNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 2022-6-21Suzhou University87DNA

49、DNA自动测序结果举例自动测序结果举例目目 录录2022-6-21Suzhou University88基基 因因 文文 库库Gene LibraryGene Library第第 四四 节节2022-6-21Suzhou University89基因组基因组DNADNA文库文库 (genomic DNA library)(genomic DNA library)cDNAcDNA文库文库 (cDNA library) (cDNA library) 基因文库基因文库 (gene library)(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列

50、的克隆群体。的克隆群体。2022-6-21Suzhou University90基因组基因组DNA文库文库c cDNA文库文库2022-6-21Suzhou University91第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例2022-6-21Suzhou University92筛选cDNA文库1. 合成寡核苷酸探针；合成寡核苷酸探针； 由于密码子的兼并性我们无法确定一个肽链由于密码子的兼并性我们无法确定一个肽链的的cDNA序列，但我们可采取以下策略：序列，但我们可采取以下策略： （1）.兼并寡核苷酸探针；兼并寡核苷酸探针； 设计一组涵盖可编设计一组涵盖可编码一