血红蛋白的提取和分离.ppt

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1、课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离专题专题5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术思考思考1 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构思考思考2 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便，便于进行于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于核，结构简单，血

2、红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。提取血红蛋白。 在红细胞的组成在红细胞的组成中，约中，约90%是血红是血红蛋白。它由蛋白。它由四个肽四个肽链链组成，包括两个组成，包括两个肽链和两个肽链和两个肽链。每条肽链环肽链。每条肽链环绕一个绕一个亚铁血红素亚铁血红素基团，可携带基团，可携带一分一分子氧或一分子二氧子氧或一分子二氧化碳化碳。血红蛋白因。血红蛋白因含含血红血红素而呈现红素而呈现红色。色。（四）血红蛋白（四）血红蛋白二二 实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂

3、葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（ ）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链90（一）样品处理（一）样品处理 1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。血浆；用生理盐水洗涤。 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放

4、 3、分离血红蛋白溶液、分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。漏斗分出红色透明液体。 4、透析、透析： 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析。透析。红细胞的洗涤红细胞的洗涤分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀暗红色沉淀物物（二）（二） 凝胶色谱法凝胶色谱法-纯化血红蛋白纯化

5、血红蛋白 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。胶的分子筛作用，来进行分离。凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（ ）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内部的通

6、道，路程（凝胶内部的通道，路程（ ），移动速），移动速度（度（ ），而（），而（ ）的蛋白）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（）移动，路程（ ），移动速），移动速度（度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。此得以分离。4、具体过程、具体过程相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管厘米的玻璃管 底塞的制作底塞的制作 顶塞的制作顶塞的制作 组装组装 安装其他附属结构。安装其他

7、附属结构。 材材料：料：交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶计计算并称取一定量的凝胶浸泡于算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 注注意：意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。之间的空隙。 2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果效果。正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁

8、加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。洗脱血红蛋白洗脱血红蛋白 1、概念：在一定的范围内，能对抗外、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液： 2、作用：、作用： 能够抵制（能够抵制（ ）的对溶液）的对溶液的（的（ ）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（

9、）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（就可以制得（ ）使用的）使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3（三）（三） 电泳电泳-鉴定血红蛋白鉴定血红蛋白1、概念：指带电粒子在电场作用下发、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。生迁移的过程。 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是液是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模，目的是利用缓冲液模拟细胞内

10、的拟细胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的正环境，保证血红蛋白的正常常结构结构和和功能功能，便于观察（，便于观察（红色红色） 2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有）等都具有( ) 在在( )下下，这些基团会带上，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身）以及分子本身（ ）、（）、（ ）的不同使带电分子的不同使带电分子产生不同的（产生不同的（ ），从而实现样），从而实现样品中各种分子的分离。品中

11、各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH常用常用-聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳测定（测定（ ）通）通常用十二烷基硫酸钠（常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀聚丙稀酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量SDSSDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDSSDS复合物，复合物，SDSSDS所所带带负电荷负电荷的量大的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电

12、荷因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于差别，使电泳迁移率完全取决于( )( )。分子的大小分子的大小答答: :血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步, ,包括包括: :样品处理样品处理, ,粗分离粗分离, ,纯化和纯度鉴定纯化和纯度鉴定. . 通过洗涤红细胞通过洗涤红细胞, ,血红蛋白的释放血红蛋白的释放, ,收集血红蛋白溶液收集血红蛋白溶液-样品的处理样品的处理; ; 经过透析去除分子量较小的杂质经过透析去除分子量较小的杂质-样品的粗分离样品的粗分离; ; 通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质

13、蛋白除去-样品的纯化样品的纯化; ; 经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质纯度鉴定质纯度鉴定. .答答: :血红蛋白是有色蛋白血红蛋白是有色蛋白, ,因此在凝胶色谱分离时可以通因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液. .这使血红这使血红蛋白的分离过程非常直观蛋白的分离过程非常直观, ,大大简化了实验操作大大简化了实验操作. .4.4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? ?5.5.与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比, ,红细胞有什么特点红细胞有什么特点? ?这一特点对你进行蛋白

14、质的分离有什么意义这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义? ?2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺

15、电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子分子数和数和CO2分子数分别是分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序分层顺序自上而下自上而下是：是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀