温州医学院 临床免疫学检验系列 (17).ppt

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1、第十二章免疫组织化学技术,温州医科大学检验医学院王彩虹,免疫组织化学技术（immunohistochemistrytechnique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。,概念,第一节免疫组织化学技术概述,根据标记物的不同分类：荧光免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术亲和组织化学技术免疫电镜组织化学技术,第一节免疫组织化学技术概述,免疫组织化学的基本过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将标记物与抗体结合形成

2、标记抗体；4.标本的处理与制备；5.抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应；6.观察结果。,标本的主要来源活体组织各种体液及穿刺液培养细胞,一、标本的处理,组织切片技术石蜡切片：对组织结构形态保存好，是观察组织和细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究，但对抗原的保存不如冰冻切片。冰冻切片：能避免石蜡切片应固定、脱水、浸蜡等对抗原的损失，较好的保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。,标本的固定良好的固定是免疫组织化学结果可靠的重要保证固定目的：凝固蛋白，终止细胞内酶的作用，防止细胞自溶，保持细胞形态和结构保持组织细胞的抗原性防止组织或细胞脱落去除细胞内妨碍抗体结合的类脂，便于保存防腐,固定的

3、原则：不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与结合固定剂的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂,各种抗原的固定,二、抗原的保存与修复,抗原修复:使在制片过程中被遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的过程。常用的方法：酶消化法：无花果酶（轻度）、胰蛋白酶（中度）和胃蛋白酶（强）盐酸水解法：注意浓度、温度和时间微波法：微波是一种高频电磁波，可以打开蛋白质之间的交联键，从而使抗原修复。高压锅法、煮沸法：高温可以使某些已经封闭的抗原表位得以重新暴露和修复。,三、抗体的处理与保存,抗体的选择,注意选择具有高特异性、稳定的优质抗体

4、多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低,抗体的稀释,抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度,抗体的保存,分装密封保存，避免对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价、量）根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻融而使抗体效价降低,四、结果判断,对照实验：阳性对照：选择含已有抗原的标本(证明整个显色程序正确，尤其待检标本呈阴性结果时更为重要）阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）确证实验：空白实验：PBS（排除内源性酶）替代试验：与待测抗原的同种动物非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗原引起的非特异性反应）吸收或阻

5、断试验：用过量已知抗原（可溶性）与特异性抗体反应，已知阳性的标本应呈阴性或弱阳性（证明免疫组化的阳性结果是与天然抗原相同的抗原抗体反应。）,阴性对照,阳性对照,吸收实验,PBS,替代实验,待测组,阳性细胞显色分布类型细胞质细胞核细胞膜表面,阳性细胞显色：抗原分布于细胞核,阳性显色深浅反映抗原存在的数量定性的依据定位的依据定量的依据,阳性细胞分布可呈散在分布灶性分布弥漫性分布,阳性细胞呈灶性分布,阴性结果及抗原不表达,阴性结果:不能简单认为具有否定意义，因为阳性表达有强弱、多少之分，哪怕只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也要视为阳性表达不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。,特异性染色与非特

6、异性染色,免疫组化结果与HE染色结果,当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时,应再结合临床资料，如性别、年龄、部位、X线等影像学及实验室结果综合分析,不能简单地推翻HE切片诊断。,五、质量控制,抗体特异性、敏感性测试抗体最佳稀释度的选择稀释剂孵育温度、时间非特异性染色：缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制，这是最重要的一条。一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。,试剂的质量控制,操作过程质量控制,操作：步骤是否正确规范；每日之间、操作人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好标本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型质控品，可用于监控标本制备、操作过程、染色步骤、试剂质量等问

7、题引起的误差,仪器的质量控制,相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒,第二节酶免疫组织化学技术,定义:用酶标抗体(抗原)与组织或细胞标本中的抗原(抗体)发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原(抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。,一、组织处理,常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等，其固定及标本制作方法见第一、二节。与荧光免疫技术相比，酶免疫组织化学技术具有染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点。,二、酶标记抗体免疫组化染色,定义:借助交联剂共价键将酶直接连接在抗体上，酶标抗体与靶抗原反应后，再通过对底物的特异性催

8、化作用，生成不溶性有色产物，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。常用的方法:直接法、间接法,三、非标记抗体酶免疫组化染色,特点:用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的抗体结合，最后经酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测避免了酶标记抗体对抗体的损伤，提高了方法的敏感性,酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过第二抗体作桥抗体，将结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色,优点：敏感性较酶标法有所提高缺点：操作分四步，较复杂如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着

9、色问题如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗结合，结果就与抗酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的敏感性,PAP法：是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物),操作只需三步PAP复合物稳定，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端敏感性高背景着色淡即使桥连抗体存在有非特异性抗体，因其与第一抗体并非同种属，故不能与抗酶抗体结合如果抗酶抗体中存在的非抗酶抗体，虽可与组织成分结合，但此抗体不能与酶结合，不会有酶活性。,双桥PAP法：是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。这种放大方式重复使

10、用桥抗体，使桥抗与PAP复合物中的抗酶抗体未充分饱和的Fc段结合，或桥抗体与特异性一抗尚未饱和的Fc段结合。对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测有实用价值。,APAAP法：有些组织细胞富含内源性过氧化物酶，染色时就不宜使用HRP体系。用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP)-抗碱性磷酶(AAP)法，简称APAAP法,如淋巴组织和肿瘤组织中含HRP高，可以AP代替。,四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物,常用种类:辣根过氧化物酶/HRP底物显色（DAB)棕色或(AEC)橘红色最常用碱性磷酸酶/AP底物显色红色(-萘酚磷酸盐与快红反应）或深蓝色(-萘酚磷酸盐与快蓝反应）;紫蓝

11、色（靛蓝四唑）最敏感酶的选择:HRP染色结果比AP染色结果保存时间长含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为APAP和HRP结合可进行双重或三重免疫组化标记,对比清晰,第三节免疫荧光组织化学技术,定义:采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，分辨出抗原(或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量，以达到对抗原(或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。,一、组织的处理,标本的类型：涂片和印片组织切片细胞培养标本活细胞标本的保存：标本固定干燥后，最好立即染色镜检保持干燥、置4甚至-20

12、以下保存,二、荧光免疫组化染色,直接法：优点：操作简便、特异性高缺点：敏感度偏低、抗体制备麻烦,间接法：优点：较直接法灵敏，标记一种抗体可以鉴定多种抗原缺点：非特异荧光、操作时间较长,双标记荧光免疫染色法：用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本中的相应两种抗原同时显示,第四节亲和组织化学技术,亲和组织化学（Affinityhistochemistry）是利用两种物质之间的高度亲和力而建立的方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素、生物素和葡萄球菌蛋白A等，对某种组织成分具有高亲和力，可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合,可采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显

13、影或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。,一、生物素-亲合素法,生物素/Biotin：即维生素H，是一种碱性蛋白。亲合素/Avidin：也被称为抗生物素，它是由4个相同亚基组成的大分子糖蛋白，具有4个与生物素亲和力极高的结合点，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性，它们都具有与其它示踪剂结合的能力。,亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术AvidinBiotinPeroxidaseComplextechnique，ABC,原理：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，

14、ABC中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。,缺点：有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺等有内源性生物素活性，需要对组织进行预处理ABC复合物在中性时带正电荷，容易与细胞核等带负电荷结构非特异结合亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物结合,优点：敏感性高特异性高一抗和二抗工作浓度低操作时间缩短可以多重标记,桥联亲合素-生物素技术BridgedAvidin-Biotintechnique，BRAB,原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来，达到检测反应分

15、子的目的。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。,标记生物素-抗生物素技术LabelledAvidin-biotintechnique，LAB,原理:以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。特点:相当高的灵敏度，省略了加标记生物素步骤，操作较BRAB法简便。间接LAB法采用生物素化第二抗体，可进一步提高检测灵敏度,二、链霉亲合素-生物素法(LSAB）,链霉亲合素(StreptavidinSA)是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含

16、糖基，有4个生物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲合素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合素-生物素方法,LSAB法具有几大特点：酶标记在SA上，与生物素结合的位点呈游离状态，可结合更多的生物素化的二抗，放大效应远远超过ABC法（1-2倍）低背景着色：等电点比亲和素低，带正电荷少，与带负电荷的结缔组织结合少，背景染色低。操作时间缩短（孵育时间短），抗体用量少。,三、葡萄球菌A蛋白法,定义:葡萄球菌蛋白A（SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种动物IgG的Fc段结合，用SPA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反

17、应的各种免疫检测实验,SPA可以和人及多种动物的IgG结合，解决不同动物样本检测时，需分别标记相应二抗的问题SPA结合部位是Fc段，因此不会影响抗体的活性SPA具有双价结合力SPA对IgG亚型的结合有选择性，可能出现的假阴性结果,三、凝集素法,凝集素（lectin）是指一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，可使红细胞凝集故称凝集素。凝集素具有与特定糖基专一结合的特性，是研究肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具。凝集素法就是一方面利用凝集素可以与标记物结合，另一方面又可以与细胞膜糖基结合所形成一种亲和反应。,直接法是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。间接法是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素反应-凝集素-糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个“三明治样”的结合物。,第六节免疫组化技术的应用,荧光免疫组织化学技术的应用,肾小球抗基底膜抗体的阳性显色,自身免疫性疾病中的应用,病原体检测,SARS感染的细胞,酶免疫组织化学技术的应用,提高病理诊断准确性（HE可观察到炎性细胞浸润，ED1染色可观察到巨噬细胞浸润）,Survivin在肝癌细胞核的表达,癌基因蛋白的临床应用,Ki67在小肝癌组织中的表达,