11DNA重组技术的基本工具79.ppt

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1、1.1DNA1.1DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题专题1 1 基因工程基因工程基因工程基因工程基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果 基因工程基因工程是指按照人们的愿望，进行严格是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外的设计，通过体外DNADNA重组和转基因等技术，重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。需要的新的生物类型和生物产品。基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分

2、子水平分子水平剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达人类需要的基因产物人类需要的基因产物基因工程产品基因工程产品延熟保鲜转基因西红柿延熟保鲜转基因西红柿 研究者发现，控制植物衰老激素研究者发现，控制植物衰老激素乙烯乙烯合成的酶基合成的酶基因，是导致植物衰老的重要基因，如果能够利用基因因，是导致植物衰老的重要基因，如果能够利用基因工程的方法抑制这个基因的表达，番茄就不会容易变工程的方法抑制这个基因的表达，番茄就不会容易变软和腐烂了。软和腐烂了。 抗虫的基因来自苏云金杆菌。抗虫的基因来自苏云金杆菌。苏云金杆菌形成的苏云金杆菌形成的伴胞晶体是一种毒性很强的蛋白晶体，能使棉铃虫等伴胞晶体是一种毒性很强的蛋白

3、晶体，能使棉铃虫等鳞翅口害虫瘫痪致死。鳞翅口害虫瘫痪致死。科学家将编码这个蛋白质的基科学家将编码这个蛋白质的基因导入作物，使作物自身具有抵御虫害的能力。因导入作物，使作物自身具有抵御虫害的能力。抗虫棉抗虫棉 转基因鲑鱼转基因鲑鱼 玫瑰的基因不能编码合成蓝色色素，通过把三色玫瑰的基因不能编码合成蓝色色素，通过把三色紫罗兰的基因植入玫瑰，培育出含蓝色素的玫瑰。紫罗兰的基因植入玫瑰，培育出含蓝色素的玫瑰。蓝色妖姬蓝色妖姬基础理论和技术的发展催生了基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程 DNADNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明 DNADNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立

4、遗传密码的破译遗传密码的破译 基因转移载体的发现基因转移载体的发现 工具酶的发明工具酶的发明 DNADNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明 DNADNA体外重组的实现体外重组的实现 重组重组DNADNA表达实验的成功表达实验的成功 第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世 PCRPCR技术的发明技术的发明基础理论基础理论技术发明技术发明基因工程的理论基础基因工程的理论基础2.人胰岛素基因为何能在大肠杆菌体内表达？人胰岛素基因为何能在大肠杆菌体内表达？（外源（外源DNA能在受体细胞中表达的理论基础）能在受体细胞中表达的理论基础）1.不同生物的基因为什么能拼接在一起？不同生物的基因为什么能

5、拼接在一起？（不同生物基因能拼接在一起的理论基础）（不同生物基因能拼接在一起的理论基础）“分子手术刀分子手术刀” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子缝合针分子缝合针”“分子运输车分子运输车”“分子手术刀分子手术刀”主要在原核生物中主要在原核生物中1.1.来源：来源：2.2.功能：功能：能识别双链能识别双链DNADNA分子的分子的某种特定核苷酸序列某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间部位的两个核苷酸之间的的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶( (简称限

6、制酶简称限制酶) )黏性末端黏性末端平末端平末端3.3.结果：结果：什么叫磷酸二酯键？什么叫磷酸二酯键？ T12345 A12345HHHHHO T12345 A12345HHHHO+ H2O磷酸二酯键磷酸二酯键CT TCATGAATTCCGTACCCGGGCCTAA GAAGTACTTAAGGCATGGGCCCGGATT EcoREcoR限制酶限制酶酶切位点酶切位点GAATTC GCTTAASmaSma限制酶限制酶酶切位点酶切位点 GGGCCCEcoEcoR R限制酶只识别限制酶只识别GAATTCGAATTC，并在，并在GAGA间切割间切割SmaSma限制酶只识别限制酶只识别CCCGGGCC

7、CGGG，并在，并在GCGC间切割。间切割。例如：例如： CCC GGG什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 用同一种限制性酶处理不同用同一种限制性酶处理不同DNADNA片段，会形片段，会形成成同样的黏性末端同样的黏性末端，可进行重组。可进行重组。切割切割DNADNA分子时产生的两种不同末端分子时产生的两种不同末端限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列有什么特点？ 限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是个碱基还是4个个碱基，都可以找到一条中心轴线碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双中轴线两侧的双链链DNA上的碱基是上的碱基是反向对称重复排列反向对称重复排

8、列的。的。限制酶识别序列的中心轴线限制酶识别序列的中心轴线 原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNADNA的入侵，限制的入侵，限制酶是一种防御工具，当外源酶是一种防御工具，当外源DNADNA侵入时，会利用限制侵入时，会利用限制酶将外源酶将外源DNADNA切割掉，使之失效，保证自身的安全。切割掉，使之失效，保证自身的安全。 因为含有某种限制酶的细胞，其因为含有某种限制酶的细胞，其DNADNA分子中或不分子中或不具备这种限制酶的识别序列，或通过甲基化酶将甲具备这种限制酶的识别序列，或通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不

9、能将其切开。切开。l限制酶在原核生物中的作用是什么吗？限制酶在原核生物中的作用是什么吗？l为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNADNA？属名属名种名种名菌株菌株( (品系品系) )大肠杆菌大肠杆菌R型菌株分离出的第一个限制酶型菌株分离出的第一个限制酶EscherichiacoliREcoRI种名前两字母种名前两字母( (小写、斜体小写、斜体) )菌株菌株 ( (品系品系) )罗马数字区分同一菌罗马数字区分同一菌株分离出的不同酶株分离出的不同酶例：流感嗜血杆菌例：流感嗜血杆菌( (Haemophilus influenzae)d株系中株系中第二种限制酶的命名：

10、第二种限制酶的命名：Hind II 粘质沙雷氏粘质沙雷氏菌菌( ( Serratia marcescens sb) )中第一种中第一种限制酶的命名：限制酶的命名：Sma I属名首字母属名首字母( (大写、斜体大写、斜体) ) DNADNA连接酶连接的是两个脱氧核苷酸分子的什么连接酶连接的是两个脱氧核苷酸分子的什么部位？部位？“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶CTTAAGAATTCG磷酸二酯键磷酸二酯键3.DNA3.DNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶一样吗？为什么？聚合酶一样吗？为什么？ 1.1.比较比较DNADNA连接酶与限制性核酸内切酶连接酶与限制性核酸内切酶2.2.比较

11、限制性核酸内切酶与解旋酶比较限制性核酸内切酶与解旋酶GCTTAAGCTTAADNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶一样吗？为什么？聚合酶一样吗？为什么？ 练一练练一练限制酶限制酶（作用于磷酸二酯键）（作用于磷酸二酯键）DNADNA连接酶连接酶（作用于磷酸二酯键）（作用于磷酸二酯键）解旋酶解旋酶（作用于氢键）（作用于氢键）DNADNA聚合酶聚合酶（作用于磷酸二酯键）（作用于磷酸二酯键）“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶的种类连接酶的种类种类种类EcoliDNADNA连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶来源来源连接末连接末端类型端类型共性共性T4T4噬菌体噬菌体大肠杆菌

12、大肠杆菌只能连接黏性末端只能连接黏性末端既可连接黏性末端，既可连接黏性末端，又可连接平末端。又可连接平末端。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链接双链DNADNA的缺口，的缺口，而不能连接单链而不能连接单链DNADNA。基因的载体基因的载体“分子运输车分子运输车”载体必须具备的条件：载体必须具备的条件：3 3、具有、具有标记基因标记基因，供重组，供重组DNADNA的鉴定和筛选。的鉴定和筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）2 2、具有一个或多个、具有一个或多个限制酶切点限制酶切点，供外源，

13、供外源DNADNA插入；插入；1 1、能够在宿主细胞内稳定保存并、能够在宿主细胞内稳定保存并自我复制自我复制；4 4、对受体细胞无害对受体细胞无害。载体的作用：载体的作用：1 1、将外源基因转移到受体细胞中去。、将外源基因转移到受体细胞中去。2 2、利用载体在受体细胞内对外源基因进行大量复制。、利用载体在受体细胞内对外源基因进行大量复制。5 5、分子大小适宜，分子大小适宜，以便提取和体外操作。以便提取和体外操作。 是基因工程最常用是基因工程最常用的运载体，它广泛地存的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的色体外能够自主复制的很小的环状很小的环状DNADNA分子，分子，大小只有普通细菌拟核大小只有普通细菌拟核DNADNA的百分之一。的百分之一。要对天然质粒进行人工改造要对天然质粒进行人工改造质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等。噬菌体的衍生物，动植物病毒等。常用的载体：常用的载体：质粒质粒质粒质粒病毒病毒 ( (噬菌体和动植物病毒噬菌体和动植物病毒) )基因的载体基因的载体“分子运输车分子运输车”