基因克隆和表达的载体.ppt

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1、2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide1,基因工程GeneEngineering,授课课时:40学时，实验：20学时(S502),第3周开始(1单2双周)考试方式:笔试上课地点:1208，3511（69周）任课教师:谭志远教授，办公室，S508联系电话:85288311,Emailzytan,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide2,课程要求,通过本课程的学习，掌握基因工程的一些基本原理和基本操作技术等。总成绩平时（20）实验（30）考试（50）平时成绩(考查迟到、早退，课堂提问、讨论、遵守课堂纪律等方面),202

2、0年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide3,教材和参考文献,楼士林等，基因工程，科学出版社，2002吴乃虎，基因工程原理（第二版上、下册），科学出版社，1998张惠展编著，1999年出版，基因工程概论，华东理工大学出版社。Watson,J.Detal.RecombinantDNA,W.H.FreemanandCompany,NewYork,2ed,1992RobertF.Weaver,MolecularBiology,科学出版社,2000（影印版）,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide4,本课程内容,第一章绪论第二章基因

3、克隆的工具酶第三章基因工程的载体第四章目的基因的制备第五章目的基因导入和重组子的筛选第六章外源基因的表达第七章基因操作的基本技术第八章植物基因工程及应用第九章动物基因工程及应用第十章医学基因工程及应用,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide5,第三章基因工程的载体,3.1载体的功能及其特征3.2质粒克隆载体3.3病毒（噬菌体）克隆载体3.4酵母载体3.5人工染色体克隆载体,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide6,3.1载体的功能及其特征,载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。载体：指能够运载外源DNA片段（目的

4、基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。载体的功能:1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件,作为工程载体必备的条件,具有多个单一的限制性内切酶酶切位点有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。具有筛选转化子的选择性标记基因安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。分子量小，拷贝数多。携带外源基因的幅度宽,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课

5、！,Slide7,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide8,自主复制型载体和附加载体的扩增方式,载体的类型,应用范围：克隆载体、表达载体。应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide9,克隆载体(cloningvector),用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、

6、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide10,表达载体(expressionvector),使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide11,穿梭载体(shuttlevector),又称双功能载体(bifunctionalvector)。能在两种不同的生物体内复制的载体。同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它即能在原核

7、细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide12,病毒载体(virusvector),常用的动物病毒表达载体可分为两大类：整合型（integrated）载体:即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是SV40PSV系列和逆转录病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV等。游离型(transient)或称病毒颗

8、粒型载体:这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗粒的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒,载体从构建来源分,质粒载体病毒或噬菌体载体质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide14,3.2质粒克隆载体,3.2.1质粒的生物学特性3.2.1.1质粒DNA的复制3.2.1.2质粒DNA的不亲和性或互不相容性3.2.1.3质粒的转移和迁移性3.2.1.4质粒的重组性3.2.1.5显性质粒和隐性质粒3.2.2质

9、粒载体的构建3.2.2.1理想的质粒载体应具备的条件3.2.2.2构建质粒载体应遵循的原则3.2.2.3常见质粒载体及其构建3.2.2.4质粒载体的评价,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide15,质粒（plasmid）,指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的DNA分子。广泛存在于细菌细胞中，在某些蓝藻、真菌和绿藻细胞中也发现；在酵母、眼虫、衣藻等真核生物中也存在。绝大多数为环状双链DNA分子；极少数为线性质粒和RNA质粒。环状双链质粒DNA的三种构型：超螺旋(SC)/共价闭合环形(cccDNA,covalentlyclosedcircularDN

10、A)；开环(oc-DNA,opencircularDNA)；线性(L-DNA,linearDNA),2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide16,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide17,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide18,3.2.1质粒的生物学特性,（一）自主复制性质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复

11、制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。（二）不相容性利用同一复制系统的不同质粒（RNAIRNAIIRop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide19,（三）可扩增性质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全

12、依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。但另外两种质粒（psc101和p15A）的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide20,（四）可转移性在天然条

13、件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。,3.2.1.1质粒DNA的复制,受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制质粒：（1）复制起点（2）控制质粒DNA复制强度的有关基因：cop:指令宿主细胞合成阻遏物，阻遏物的累积阻止质粒的继续复制。rep:指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制。par序列:该序列附着在细胞膜上，使质粒分子在细胞分裂时正确地分配到子细胞中，维持相对稳定的拷贝数。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide21,松弛型和严谨型质粒,拷贝数（copies）：指一个宿

14、主细胞内某种质粒的数量与宿主染色体数量（通常为一条染色体）之比。严谨型质粒(stringentplasmid):拷贝数为1至几个的质粒。松弛型质粒(relaxedplasmid):拷贝数多于10个的质粒。严谨或松弛与质粒的大小及宿主类型有关。含松弛型质粒的细菌在含氯霉素的培养基中培养时，可使质粒大量扩增。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide22,3.2.1.2质粒DNA的不亲和性或互不相容性（incompatibility）,指在无选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。亲和性质粒：指能同寓于一细胞中的不同质

15、粒。不亲和性质粒：指不能同寓于一细胞中的不同质粒。一般为亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide23,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide24,质粒不亲和性的机制,受相同阻遏物的制约在细胞膜上有相同的结合位点,3.2.1.3质粒的转移和迁移,接合质粒(conjugativeplasmid)：指质粒所携带的基因的功能是使细胞彼此有效地接触，以便将质粒DNA从供体细胞转移至受体细胞。如：质粒上的tra基因使宿主细胞（大肠杆菌）产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与

16、受体细胞接合。分子较大、拷贝数少、宿主广、自行接合转移、较不安全。如：F质粒、Ti质粒等。非接合质粒(non-conjugativeplasmid)：分子小、拷贝数多、不会自行接合转移，安全。如：ColE1质粒等。基因工程中选用,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide25,迁移作用(mobilization),指在接合质粒的共存下引发的非接合质粒的转移特性。由mob和bom两个基因控制基因工程常利用mob和bom基因缺陷型（mob,bom）的质粒和菌株,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide26,3.2.1.4质粒

17、的重组性,由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。在基因工程应用的是重组缺陷型（rec）的质粒和菌株。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide27,3.2.1.5显性质粒和隐性质粒,显性质粒（表达型质粒）：指携带除与自身复制和转移相关的基因，还携带一些使宿主细胞呈现新性状基因的质粒。如：抗抗菌素的抗性质粒（R质粒）；产大肠杆菌素（colicins）的Col质粒；引起细胞接合的育性质粒（F质粒）；降解金属有机物、芳香烃和农药等毒物降解的降解质粒；及致植物形成冠瘿瘤的Ti质粒。隐性质粒：宿主含有某种质粒，但无异样的性状表现出来，这样的质粒称隐性质粒。,

18、2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide28,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide29,根据质粒基因编码的特性将质粒分为五大类,Fertility/F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移外没有其他功能。Resistance/R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，发现于假单胞杆菌。Col质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E.coli中的CoE1。降解质粒（Degradativeplasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。致瘤质粒（Virulenceplasmids）：农杆菌Ti质

19、粒。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide30,利用抗性基因进行重组子的筛选,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide31,3.2.2质粒载体的构建,3.2.2.1理想的质粒载体应具备的条件3.2.2.2构建质粒载体应遵循的原则3.2.2.3常见质粒载体及其构建3.2.2.4质粒载体的评价,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide32,引序,（一）天然存在的两种质粒（1）colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制20-30/cell（2）pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8k

20、b严谨型复制5copy/cell标记基因为Tcr质粒的命名p小写代表质粒；后面有两至三个大写字母代表发现者或构建者的姓名。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide33,（二）质粒人工构建的目的天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。,

21、3.2.2.1理想的质粒载体应具备的条件,分子量较小。松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有一个强的选择标记。具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。能够导入寄主细胞，具备转化的功能。操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质粒载体。天然质粒载体的局限性：天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的都是人工构建的质粒。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide34,3.2.2.2构建质粒载体应遵循的原则,选用合适的出发质粒正确获得构建质粒

22、克隆载体的元件根据要转化的受体细胞的特性，组装合适的选择标记基因。构建质粒表达载体，选用合适的启动子。力求构建过程简单化,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide35,3.2.2.3常见质粒载体及其构建,人工构建的质粒根据其功能及用途分为:1.多拷贝质粒复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。2.测序质粒3.整合质粒装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上4.穿梭质粒含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技

23、术班同学们听课！,Slide36,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide37,5.表达质粒装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达6.探针质粒筛选克隆或寻找基因元件，通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等(下图)。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide38,实验室常用质粒：,1.pBR322质粒载体的构建：出发质粒：pMB1:类似松弛型ColE1质粒pSF2124:含Ampr基因pSC101:含Tcr基因,2020年3月8日9时51

24、分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide39,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide40,pBR322质粒载体的优缺点,优点：分子量小：4363bp,容易纯化。含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被PstI,PvuI,SacI切开，而四环素抗性基因可被BamHI,HindIII切开，通过插入失活筛选重组子。受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素，可达到1000-3000拷贝，cpoi

25、es。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide41,缺点：有被动迁移的可能，不够安全。抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide42,pBR322质粒载体,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide43,2.pBR327：一个多拷贝质粒,pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段，但改变了质粒的复制和接合能力。他与pBR322这要有两点不同：1）pBR327比pBR322有更高的拷贝，

26、每个细胞中含有30-45个拷贝。但正常细胞中较高的拷贝数，使它适合于应用于基因功能研究。2）剪切破坏了pBR322的接合能力，pBR327不具有接合能力，不能直接转入其他细胞。这对生物biologicalcontainment是非常重要的（生物防范）。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide44,pBR327：一个多拷贝质粒,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide45,3.pUC8Lac选择质粒,pUC8也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位

27、点集中在lacZ基因内的一个小片段上。pUC8的优点：1）突变位点位于复制起点，复制前可以使细胞中质粒的拷贝数达到500-700个，可以提高载体的产量。2)重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal,IPTG，节约了一半的时间。3）pUC8的多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide46,2020年3月8日9时51分,欢

28、迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide47,4.pGEM3Z-DNA的体外转录,pGEM3Z与pUC载体非常相似，不同的是pGEM3Z含有两段额外的短的DNA片段，每一段可以作为RNA聚合酶的识别位点。这两段启动子存在于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组的pGEM3Z载体中加入RNA聚合酶，可以发生转录，合成的RNA可以作为探针使用，或者研究RNA的加工过程或者蛋白质的合成。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide48,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide49,实验一质粒的制备,实验课上具体讲解,3.

29、2.2.4质粒载体的评价,操作简便克隆容量有限（10kb）,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide50,3.3病毒（噬菌体）克隆载体,3.3.1噬菌体的生物学特性3.3.2噬菌体载体3.3.3柯斯载体3.3.4M13单链丝状噬菌体载体,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide51,噬菌体(phage),感染细菌的病毒,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide52,3.3.1噬菌体的生物学特性,具有对寄主的依赖性。利用寄主的蛋白合成和复制系统进行生长和繁殖。具有高感染性感染途径：溶

30、菌生长；溶原生长,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide53,噬菌体溶菌生长,溶菌生长:噬菌体感染宿主细胞后，大量增殖子代噬菌体颗粒，使宿主细胞裂解，释放出来的病毒颗粒又再感染其它细胞，这种周而复始的生命过程（生活周期）称溶菌生长。烈性噬菌体：噬菌体感染宿主细胞后，DNA不整合到宿主染色体，只进行溶菌生长，这样的噬菌体称烈性噬菌体。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide54,噬菌体溶原生长,溶原生长：噬菌体感染细菌，DNA整合到寄主染色体中，随寄主细胞染色体的复制而复制，寄主细胞仍然正常分裂，并不死亡，这种生命过

31、程叫作溶原生长。温和噬菌体（temperatephage）：病毒感染宿主细胞后DNA整合到寄主染色体中，无感染其它细胞的能力，这样的病毒，称温和噬菌体。溶原性细菌（lysogen）：细菌染色体中整合有噬菌体基因组的细菌。对同种噬菌体具有免疫性。溶原化（lysogenization）：用温和噬菌体感染细菌使之成为溶原性细菌的过程。原噬菌体（prophage）：在溶原性细菌内存在的整合噬菌体DNA，称原噬菌体。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide55,3.3.2噬菌体载体,3.3.2.1噬菌体的性质3.3.2.2噬菌体载体构建的原理3.3.2.3重组DN

32、A分子的体外包装3.3.2.4噬菌体载体的评价,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide56,3.3.2.1噬菌体的性质,野生型入噬菌体DNA为双链线性分子黏性末端(cohesiveend)：线性分子左右两端各有12bp组成的5端突出的粘性末端，DNA进入宿主细胞后黏性末端连接形成环DNA分子。cos位点(cohesiveendsite)：指在连接酶的作用下，连接上述黏性末端结合形成的双链DNA区段。又称黏性末端位点。全长48,502bp，约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的，可以缺失或被外源DNA片段所取代。入噬菌体DNA分子上有56种限制性核酸内切

33、酶识别位点。温和噬菌体，易于在溶源生长保存，在溶菌生长增殖。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide57,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide58,噬菌体的侵染循环,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide59,3.3.2.2噬菌体载体构建的原理,建立克隆载体前需要解决2个问题1）DNA分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。2）基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成基因组。.缩短长度野生型DNA包装的上限为

34、50.5kb，本身长度为48.5kb，那么外源DNA片段允许插入的大小至多为2.4kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒，如果将缩短便提高装载量。其实DNA上约有40-50%的DNA片段是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide60,DNA的结构,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide61,策略：,利用限制性内切酶切去入DNA上非必需区。采用点突变或甲基化酶处理，使入DNA上必需。区内多余的限制性内切酶识别位点失效在入DNA的非必需区内组入选择性标记基因建立重组入D

35、NA分子体外包装体系,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide63,.缩短长度:入噬菌体载体的类型插入型载体(insertionvector),该类载体经改造后的长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为13.9kb（54.9-37kb）。由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（0-13.9kb）gt10，可以携带8kb的DNA分子，插入位于阻遏基因cI内的单一的酶切位点EcoRI。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。ZAPII，含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约10k

36、b的新的DNA分子，通过lacZ基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide64,插入型载体,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide65,.缩短长度:入噬菌体载体的类型替换型载体(replacementvector),该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或saI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。显而易见，这类载体的容量不仅比插入型

37、载体大，而且有一个下限：40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。这类载体实际上已经不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去，当然这类载体的使用较为繁琐，现在商品化了的取代型载体已去除了中间片段（14kb）解决了这一问题。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide66,WES.B，两个EcoRI位点跨越替换区域，根据分子大小筛选重组子。EMBL4，可以插入20kb的DNA分子，可利用EcoRI、BamHI、SalI替换填充片段，因此可以插入不同粘端的DNA

38、片断。重组子的筛选可以根据片段的大小也可以利用Spi表现型。(课外资料)EMBL3和EMBL4是常用的基因组克隆载体，克隆外源片段的大小为9-23kb。两载体均在填充片段内含有red及gam基因。red及gam基因使噬菌体无法在一些宿主菌中生长，这些宿主菌是非类似噬菌体P2的溶源菌株（比如，这些菌株在基因组内有P2基因组的一个拷贝。当填充片段被外源片段取代时，重组菌株成为red-及gam-，能在P2的溶源菌株中生长。这一现象称为spi-筛选（对P2介入敏感）；spi-筛选不利于亲代载体，可降低非重组子的数目。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide67,

39、取代型载体,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide68,.修饰酶切识别位点,天然的-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI5个，HindIII7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的品系。自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide69,通过自然选择法筛选无EcoRI识别位点,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同

40、学们听课！,Slide70,-DNA的抽提,1)大肠杆菌培养至对数生长期（在含有乳糖的培养基中）2)加入-噬菌体或重组噬菌体悬浮液，37培养1小时3)用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时4)高速离心，沉淀噬菌体5)苯酚抽提，释放-DNA6)乙醇或异丙醇沉淀DNA,3.3.2.3重组DNA分子的体外包装,入噬菌体DNA必须进行体外包装，才能成为有活性的病毒颗粒。入噬菌体的包装容量为野生型入噬菌体DNA（48kb）的75105，即约36.451kb.从入噬菌体突变株感染的溶原菌株，提取噬菌体包装所需的全部蛋白质。,2005年8月11日6时44分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide71

41、,3.3.2.4噬菌体载体的评价,-DNA作为载体的优点1)-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌2)-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量3)重组-DNA的筛选较为方便,可进行正向筛选和杂交筛选。4)重组-DNA分子的提取比质粒容易操作较复杂,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide72,3.3.3柯斯质粒载体或称粘粒(cosmid),cosmid:cossite-carryingplasmid杂种质粒是一类人工构建的含有入DNAcos位点、噬菌体包装有关的DNA短序列（具有噬菌体的高感染性）、质粒DNA复

42、制子、抗生素标记基因等元件的特殊质粒载体。在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide73,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide74,（一）考斯质粒的构建-DNA载体的最大装载量为25kb,有的往往需要构建克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒就是应这种需要而人工组建的。考斯质粒顾名思义就是含有-DNA两端cos区的质粒。由于-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，约1.5kb长。如果将这一小段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载

43、更大的外源DNA片段，同时它仍可象-DNA一样，被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌，与噬菌体DNA所不同的是，考斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进入细胞后，质粒上的复制子进行复制。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide75,Cos质粒pJB8,（二）Cosmid载体的特点,为双链环状DNA分子。分子小，约46kb，可容纳大40kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因组文库。具有质粒的特性，可以转化大肠杆菌，并按质粒的复制方式进行复制和增殖。具有噬菌体的特性，在体外进行包装后，可高效转导大肠杆菌，但不能进

44、入溶菌和溶原生长，不能产生子代噬菌体。含有抗药性基因，可进行插入失活筛选。由于非重组体很小，不能在体外包装,因此非重组体的本底很低，利于重组克隆的筛选。由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide77,3.3.4M13单链丝状噬菌体载体,（一）M13单链噬菌体的分子生物学：M13是一种线状、单链DNA噬菌体，总长6407bp。M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。噬菌体首先吸附大肠杆菌的雄性鞭毛上，然后穿过鞭毛内孔将DNA注入细菌体内。单链DNA利用宿主细胞复制另一条链（负链），形成双链DNA（RFDNA），然

45、后以负链为模板，滚筒式复制串联式上链分子，当拷贝数达到100-200时，负链上的基于产物干扰复制，使其停止，同时，由两条链上编码的蛋白基因表达，包装正链，并分泌至体外，宿主细胞不会发生裂解。细菌细胞每分裂一次，大约可以释放1000个新的病毒颗粒。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide78,M13噬菌体的侵染循环,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide79,（二）M13-DNA载体家族,1.M13mp载体家族M13-DNA上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是插入标记基因如，lacZ、多克隆位点，消除多余的酶切

46、位点。在M13上引入lacZ基因，产生了M13mp1，这样就可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。M13mp1载体不含有任何的单一切点的的识别序列，在基因的起始端，含有6碱基的序列GCATTC，是一个EcoRI位点，这是通过体外定点突变获得的，产生了M13mp2。M13mp2,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide80,是最简单的M13克隆载体，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位点，在X-gal培养基上可以很容易的区别出来。M13载体的构建的第二步是将限制性内切酶位点引入lacZ基因，这一步是通过合成短的多聚核苷酸称为polylinker，含有一系列

47、的限制性位点和EcoRI粘端，完成的。多聚接头插入到M13mp2的EcoRI位点上，就产生了M13mp7。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide81,外源基因由M13mp8向M13mp9载体的转,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide82,2.噬菌粒（Phagemid）,质粒与M13-DNA的重组体，它带有质粒上的酶切位点及标记基因，这样便于筛选及克隆，同时由于不含包装蛋白基因，载体本身长度减少，装载量增大，比质粒大，但不及-DNA。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide

48、83,pEMBL8的结构,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide84,将pEMBL8转化为单链形式,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide85,（三）M13-DNA作为载体的优点及用途,最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链，用途：（1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序（2）用于单链DNA的定点诱变（3）用于合成探针,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide86,3.4酵母载体,酵母是生物技术中最重要的生物体之一，除了酿酒和生产面包外，也被用来作为基因克隆的受体生产

49、药物。在酵母S.cerevisiae的大部分品系中都发现了质粒的存在，它是一个2um环状的分子。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide87,(一)2um质粒的选择标记,2um质粒是非常好的克隆载体，它有6kb大小，在酵母细胞中的拷贝数在70-200之间，利用质粒的复制起始位点进行复制，许多酶由寄主细胞提供，质粒中含有编码蛋白质的基因REP1,REP2。2um质粒的问题：选择标记的问题。在实践中，利用酵母的正常的基因，一般是编码氨基酸合成的酶，如LEU2基因编码-异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。为了利用LEU氨酸作为选择标记，需要用到一种特殊的寄主，寄主必须是LEU-2营养缺陷体这样的寄主只有在添加亮氨酸的条件下才能生长。质粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培养基上生长。,2020年3月8日9时51分,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide88,leu-作为酵母载体的