氨基酸生产工艺-ppt课件.ppt

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1、第十章初级代谢产物,本章主要内容,第一节、氨基酸生产工艺第二节、有机酸生产工艺第三节、有机溶剂生产工艺第四节、核苷类物质生产工艺第五节、维生素生产工艺第六节、再生能源,第一节氨基酸生产工艺,一、氨基酸简介二、发酵法生产氨基酸三、谷氨酸发酵机制及工艺,一、氨基酸简介,氨基酸发酵氨基酸：合成法、抽提法氨基酸工业起源于日本1909年面筋酸水解生产谷氨酸1956年由发酵法生产谷氨酸我国氨基酸发酵工业1964年上海投产赖氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸等12种氨基酸,一.氨基酸的用途（一）食品工业甜味剂：甘氨酸、丙氨酸酸味剂：天门冬氨酸、谷氨酸等鲜味剂：天门冬氨酸钠、谷氨酸钠等甘氨酸：可用于清凉饮

2、料赖氨酸：加强食品、饲料,天冬甜肽（Aspartom）：L-Asp和L-phe合成美国Searle公司30年前低热量营养性甜味剂口感近似蔗糖，甜度为蔗糖的2530倍，热量仅为蔗糖的1/160，全球总销量已1.5万吨阿丽泰(Alitame)：由天冬氨酸与丙氨酸合成甜味更纯正，耐热性更好，最适用于面包、饼干、蛋糕等焙烤食品,聚赖氨酸：食品保鲜剂、肉类、家禽、海产、面包饼干和各种谷物食品的防腐保鲜；高级吸水性聚合物：婴儿尿片等产品日本年产已达1千多吨,聚谷氨酸：绿色塑料食品包装到一次性餐具和其它各种工业用途它在自然界中可迅速降解不环境污染日本已开发成功并有产品上市,（二）医药工业1.氨基酸混合液：高

3、营养液2.治疗用：1）肝脏治疗：精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、天冬氨酸用以降低血氨异亮氨酸、亮氨酸等纠正血浆氨基酸失衡蛋氨酸、胱氨酸用于治疗脂肪肝2）消化道疾病治疗：谷氨酰胺、苏氨酸治疗消化道溃疡,亮氨酸、谷氨酸调节胃液酸度,3）脑病治疗：L-谷氨酸与L-谷氨酰胺改善脑出血后遗症的记忆障碍-氨基酸治疗癫痫等左旋多巴用于震颤性麻痹等4）心血管治疗天冬氨酸用于心率失常,（三）化妆品胱氨酸用于护发丝氨酸用于雪花膏谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸与脂肪酸形成的表面活性剂有洗净、抗菌作用谷氨酸碱盐、精氨酸碱盐：化妆品对皮肤无刺激性,（四）其他甘氨酸为除草剂成分聚谷氨酸是合成皮革原料和表面活性剂原料,四大饲料氨基

4、酸：蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸色氨酸：提高猪的瘦肉率，减少脂肪使猪肉味道更鲜美聚精氨酸：农用地膜作为洗涤剂、废水处理剂等工业用途,氨基酸的生产方法：1.抽提法半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸的生产由于没有其他适当方法，目前还是用抽提法。2.直接发酵法按照菌株的特性，直接发酵法可分为四类,.使用野生型菌株或野生菌株的诱变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸,谷氨酸丙氨酸缬氨酸,.使用营养缺陷型突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸,赖氨酸苏氨酸苯丙氨酸酪氨酸,亮氨酸缬氨酸鸟氨酸瓜氨酸脯氨酸,缺失,限制E的浓度，解除反馈抑制,营养缺陷型菌株,野生菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基

5、中补充所缺乏的营养因子才能生长，称为营养缺陷型。,.由氨基酸结构类似物抗性突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸,赖氨酸苏氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸亮氨酸异亮氨酸,缬氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸脯氨酸蛋氨酸,.使用营养缺陷型兼抗性突变株生产氨基酸,赖氨酸苏氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸异亮氨酸,亮氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸高丝氨酸,3.添加中间产物的发酵以氨基酸的中间产物为原料，用微生物转化相应的氨基酸，这样可以避免氨基酸生物合成途径中的反馈抑制作用。,丝氨酸色氨酸,蛋氨酸异亮氨酸,4.酶法应用完整菌体或自微生物细胞抽提出酶类制造氨基酸,丙氨酸天冬氨酸酪氨酸多巴（二羟基苯丙氨酸）,色氨酸5-羟基色氨酸赖氨酸,5.合

6、成法,丙氨酸天冬酰胺甘氨酸蛋氨酸,丝氨酸色氨酸苯丙氨酸,二、发酵法生产氨基酸,由于发酵法生产氨基酸，其原料廉价易得，生产条件温和，并且随着微生物代谢调节理论研究的发展，目前大部分氨基酸都以发酵法进行生产。,典型的代谢控制发酵发酵产物氨基酸：中间代谢产物积累：要求微生物正常代谢的抑制关键：控制机制被解除，打破微生物正常代谢调节,氨基酸发酵,氨基酸发酵的代谢控制,氨基酸发酵工艺控制和选育氨基酸高产菌株的依据有以下几个方面：,控制发酵环境条件,2.控制细胞渗透性氨基酸发酵必须考虑的重要因素细胞内生物素水平高，谷氨酸不能通过细胞膜表面活性剂增加细胞膜通透性青霉素影响细胞壁合成,表面活性剂,引起细胞膜的

7、脂肪酸成分的改变，改变其通透性,抑制合成,3.控制旁路代谢,4.降低反馈作用物浓度,目的产物,缺失酶,5.消除终产物的反馈抑制与阻遏作用,目的产物,6.促进ATP积累，以利于氨基酸的生成,-酮戊二酸,谷氨酸,-谷氨酰磷酸,谷氨酸半缩醛,1-吡咯啉-5-羧酸,脯氨酸,草酰乙酸,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酸半缩醛,高丝氨酸,苏氨酸,-酮基丁酸,异亮氨酸,赖氨酸,蛋氨酸,ATP,ADP,苏氨酸脱水酶,反馈抑制,缺失,天冬氨酸激酶,高丝氨酸激酶,黄色短杆菌（异亮氨酸缺陷型）的脯氨酸发酵机制,氨基酸发酵的代谢控制,控制发酵环境条件2.控制细胞渗透性3.控制旁路代谢4.降低反馈作用物浓度5.消除终产物

8、的反馈抑制与阻遏作用6.促进ATP积累，以利于氨基酸的生成,三、谷氨酸发酵,（一）、谷氨酸发酵机制,.谷氨酸的生物合成途径主要包括：EMP途径HMP途径TCA循环乙醛酸循环CO2固定反应,总反应途径,糖经过EMP途径和HMP生成丙酮酸。一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA；另一方面，经CO2固定作用生成草酰乙酸；两者合成柠檬酸进入TCA循环，由三羧酸循环的中间产物-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。,总反应式和理论转化率,总反应式C6H12O6+NH3+3/2O2C5H9O4N+CO2+3H2O理论转化率：（147/180）100%=81.7%,EMP途径和HMP途径,E

9、MP途径,葡萄糖丙酮酸生成不同产物,2.HMP途径,6-磷酸葡萄糖-磷酸葡萄糖酸5-磷酸戊糖2C化合物5-磷酸戊糖3C化合物TCA循环,6-磷酸葡萄糖脱氢酶,戊糖代谢分解,生物素充足：HMP途径所占比例为38%生物素亚适量：HMP途径所占比例为26%,TCA、DCA循环和CO2固定,1.TCA循环,丙酮酸,乙酰CoA,丙糖-3-磷酸,草酰乙酸,柠檬酸,TCA,氧化,CO2固定,氧化,-酮戊二酸脱氢酶,-酮戊二酸脱氢酶,-酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸生物合成中非常重要谷氨酸高产菌应丧失或仅有微弱的-酮戊二酸脱氢酶活力,-酮戊二酸,琥珀酰CoA,琥珀酸,-酮戊二酸脱氢酶,若-酮戊二酸脱氢酶活力很弱，就使

10、糖代谢流进入TCA循环后受阻在-酮戊二酸处,-酮戊二酸,NH4+、谷氨酸脱氢酶,谷氨酸,2.DCA循环,乙酰CoA,草酰乙酸,柠檬酸,异柠檬酸,琥珀酸,乙醛酸,乙酰CoA,苹果酸,异柠檬酸裂解酶,苹果酸合成酶,苹果酸脱氢酶,柠檬酸合成酶,DCA循环的生理意义,作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充，特别是以醋酸和乙醇为原料的谷氨酸发酵，它是C4二羧酸的唯一补充来源作为能量供给来源的末端氧化系,TCA循环和DCA循环,以醋酸为唯一碳源的菌体实验表明：菌体内有机酸浓度低到需要DCA循环运转时，由异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶；由于DCA循环运转，TCA循环有

11、机酸过剩，异柠檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA循环运转,有机酸浓度低,乙醛酸、草酰乙酸,异柠檬酸脱氢酶抑制,DCA循环运转,DCA循环运转,TCA循环有机酸过剩,异柠檬酸裂解酶抑制,乙醛酸浓度降低,异柠檬酸脱氢酶抑制解除,TCA循环运转,在糖质原料的谷氨酸发酵中，在谷氨酸生成期，如果葡萄糖先转化为醋酸，再由DCA循环提供C4二羧酸合成谷氨酸，谷氨酸对糖的转化率就大为减少。,3C6H12O66丙酮酸6醋酸6醋酸+2NH3+3O22C5H9O4N+2CO2+6H2O,转化率：2147/（3180）100%=54.4%,在以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是谷氨酸

12、生成期DCA循环应该关闭,3.CO2固定,在谷氨酸产生菌中已检出两种CO2固定酶：磷酸烯醇丙酮酸（PEP）羧化酶和苹果酸酶,CO2,PEP,+PEP羧化酶,丙酮酸激酶,1，6-二磷酸果糖,PEP羧化酶对PEP的表现亲和力约是丙酮酸激酶的1/10,所以在谷氨酸发酵中，糖的分解代谢途径与CO2固定的适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关键问题。,生物合成和需能反应,ATP浓度降低,解除抑制丙酮酸激酶,氨的导入,氨的导入方式：糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基转给-酮戊二酸而生成谷氨酸合成酶途径,糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸,异柠檬酸脱氢酶：需N

13、ADP为辅酶，催化-酮戊二酸的生成（谷氨酸的前体），并为谷氨酸脱氢酶提供辅酶谷氨酸脱氢酶：需NADPH+H+为辅酶,活细胞中，异柠檬酸脱氢酶活性小于谷氨酸脱氢酶活性，所以NADP浓度是实际上的限速因子,异柠檬酸脱氢酶,谷氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中，谷氨酸脱氢酶对-酮戊二酸和谷氨酸表现出同促相互作用，低浓度的-酮戊二酸和谷氨酸对此酶有显著的激活作用。当谷氨酸浓度为100mmol/L时，抑制酶活65，浓度为400mmol/L时抑制90，这比其他的反馈抑制要明显的弱，因而在谷氨酸发酵中菌体内游离出来的谷氨酸浓度就要高，可以认为这个调节机制对谷氨酸生产发挥着很好的调节作用。,调节机制,调节机制,生物素细

14、胞膜通透性,葡萄糖,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰-CoA,草酰乙酸,柠檬酸,-酮戊二酸,谷氨酸,天冬氨酸,反馈抑制,增强反馈抑制,逆转反馈抑制,反馈抑制,优先合成,生物素亚适量使得最后一代细菌细胞变形、拉长，改变了细胞膜的通透性，引起代谢失调，使谷氨酸得以积累,调节机制,谷氨酸发酵中，糖代谢除受到生物素控制外，也受到NH4+的影响。使用生物素缺乏菌，在NH4+存在时，葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸。当NH4+不存在时，糖的消耗速度很慢，生成物是-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。,（二）、谷氨酸生产的工艺流程,微生物生长动力学模型的建立,培养基的配制与灭菌,菌种的扩大培养,菌体浓度,限制性基质浓度,建立微生物生长动力学模型,发酵过程中主要参数的检测,生化反应器重要参数KLa的检测,亚硫酸钠氧化法,动态法(溶氧电极法),发酵动力学实验,三角瓶培养,冷却接种,固体斜面培养,发酵,发酵液,谷氨酸生产工艺流程,pH7.0，流加尿素调节（0.40.6）,测定菌体密度，OD值不再上升时，菌体分裂完成，约12h,前期(012h)3335;中后期(35h)3638,通气比：1:(0.080.1)100吨罐,32,pH7.0,OD=1.0,32,pH7.0,1824h,