最新十五章生物技术与作物育种ppt课件.ppt

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1、第一节第一节 细胞工程与作物育种细胞工程与作物育种植物细胞工程：是以植物组织和细胞培养技术为基植物细胞工程：是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门科学。础发展起来的一门科学。它以细胞为单位，在体外（它以细胞为单位，在体外（in vitro）条件下进行培）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质过程。包括花药培养、意愿生产某种物质过程。包括花药培养、体细胞变体细胞变异筛选异筛选、幼胚培养、试管受精和、幼胚培养、试管受精和原生质体融合原生质体融合等等3、在作物改良上应用、在作物改良上应用（1）抗病）抗病（2）抗除草

2、剂）抗除草剂（3）抗氨基酸或氨基酸类似物）抗氨基酸或氨基酸类似物（4）耐盐）耐盐（5）耐旱）耐旱优良品种优良品种细胞培养细胞培养R0R0群体群体改良体细胞克隆改良体细胞克隆确定遗传方式确定遗传方式遗传稳定性测试遗传稳定性测试田间试验田间试验育种新品系育种新品系多点田间试验多点田间试验区域试验区域试验继续田间试验、种子富集继续田间试验、种子富集审定审定投入生产投入生产利用体细胞克隆变异技术路线利用体细胞克隆变异技术路线（二）单倍体细胞培养及育种利用（二）单倍体细胞培养及育种利用1 1、单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值、单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值（1 1）后代的快速纯合）后代的快

3、速纯合（2 2）提高选择效率）提高选择效率（3 3）排除杂种优势对后代选择干扰）排除杂种优势对后代选择干扰（4 4）遗传研究的良好实验材料体系）遗传研究的良好实验材料体系（5 5）突变体的筛选）突变体的筛选 母本母本 X 父本父本F1F2品系比较实验品系比较实验区域试验区域试验花药培花药培养养花药培花药培养养加倍加倍选择鉴定选择鉴定杂交育种与单倍体育种周期比较杂交育种与单倍体育种周期比较2、离体培养条件下的小孢子发育、离体培养条件下的小孢子发育（1）营养细胞发育途径）营养细胞发育途径（2）生殖细胞发育途径）生殖细胞发育途径（3）营养细胞和生殖细胞并进发育途径营养细胞和生殖细胞并进发育途径（4）

4、花粉均等发育途径）花粉均等发育途径3、影响花药培养的因素、影响花药培养的因素（1）供体植株的生长条件）供体植株的生长条件（2）供体植株的年龄）供体植株的年龄（3）花粉发育时期）花粉发育时期（4）花蕾和花药处理）花蕾和花药处理（5）培养基）培养基（6）培养条件）培养条件4、单倍体细胞培养与植物育种、单倍体细胞培养与植物育种A品种品种XB品种品种F1杂种杂种单倍体培养单倍体培养重组纯合体重组纯合体重组了重组了A和和B品种优点的纯系品种优点的纯系遗传稳定性测试遗传稳定性测试新品系新品系品种品种亲本亲本推广利用推广利用杂种优势利用杂种优势利用田间测试田间测试自交，田间测试自交，田间测试确定遗传基础确定

5、遗传基础杂交和分离测试杂交和分离测试选择选择染色体加倍染色体加倍小孢子培养或花药培养小孢子培养或花药培养三、植物原生质体培养和体细胞杂交三、植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁的、裸植物原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。露的、有生活力的原生质团。（一）原生质体的分离（一）原生质体的分离原则：保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力，原则：保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力，先决条件要有一个合适渗透压。先决条件要有一个合适渗透压。1、分离方法、分离方法（1）机械法）机械法（2）酶法）酶法n2、影响原生质体分离因素、影响原生质体分离因

6、素n（1）材料来源）材料来源n（2）渗透压）渗透压n（3）酶）酶n（4）分离培养基）分离培养基n（5）培养条件）培养条件n（6）组织前处理）组织前处理n3、原生质体的收集、纯化和活力测定、原生质体的收集、纯化和活力测定n（二）原生质体培养（二）原生质体培养n（三）细胞融合（体细胞杂交）（三）细胞融合（体细胞杂交）n1、融合方法、融合方法n（1）NaNO3处理诱发融合处理诱发融合n（2）高）高pH-高浓度钙离子处理高浓度钙离子处理n（3）PEG处理处理n（4）电融合）电融合n2、融合方式、融合方式n3、杂种细胞筛选、杂种细胞筛选n（1）形态互补）形态互补n（2）遗传互补）遗传互补n（3）代谢互补

7、）代谢互补n（4）生长互补）生长互补n4、杂种鉴定、杂种鉴定n5、细胞融合与作物育种、细胞融合与作物育种第二节第二节 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种l作物转基因育种：根据育种目标，从供作物转基因育种：根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经体生物中分离目的基因，经DNADNA重组与重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，在过筛选获得稳定表达的遗传工程体，在经过田间试验与大田选择育成转基因新经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。品种或种质资源。l常规育种技术相比，转基因育种具有很常规育种技术相比，转基因育种

8、具有很大优势：大优势： 1.可以利用的基因资源大大拓宽。可以利用的基因资源大大拓宽。 2.为培育优良品种提供了崭新的育种途径。为培育优良品种提供了崭新的育种途径。 3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择。向选择。 4.可以大大提高选择效率，加速育种进程。可以大大提高选择效率，加速育种进程。 n（一）作物的转基因技术（一）作物的转基因技术n1、转基因技术的发展现状、转基因技术的发展现状n（1）国际转基因植物研究与现状）国际转基因植物研究与现状作物 1996年 1997年 1997年/1996年 大豆玉米烟草棉花油菜合计 50301008012280 5

9、103201601401201250 10.210.71.61.8104.5 全球转基因作物种植面积比较全球转基因作物种植面积比较 （单位：万公顷）（单位：万公顷）（2）我国转基因作物研究与利用概况）我国转基因作物研究与利用概况转转Bt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现（二）转基因育种程序（二）转基因育种程序 目的基因或DNA的获取含有目的基因或者DNA的重组质粒的构建受体材料的选择和再生系统的建立转基因方法的确定和外源基因的转化转化体的筛选和鉴定转基因植株的育种利用n1、目的基因的获得n（1）根据基因表达的产物-蛋白进行基因克隆u分离和纯化控制目的性状的蛋白质或多态，进

10、行氨基酸序列分析;u根据所的氨基酸序列推导相应的核苷酸序列;u采用化学合成的方法合成该基因;u通过相应的功能鉴定来确定所推导的序列是否为目的基因。n（2）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因 A、同源序列法和表达序列标签法u同源序列法是根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点发展的一条快捷克隆即因家族未知成员的新途径，即基于同源序列的候选基因法。u表达序列标签是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的信息区，因而可以和其他基因相区分。目前，表达序列标签主要是通过cDNA的途径获得。B、根据连锁图谱克隆的基因亚克隆文库含目的基因 的亚克隆序列分析及 基因克隆

11、C、转座子标签法转座子探针亚克隆片断做探针D D、差异显示法、差异显示法l在生物个体发育的不同阶段或是在不同的组织、空间进行有序表达的方式，叫做基因的差异表达。l差异显示PCR是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带，该条代就有可能是全长或是部分特异表达的基因，利用这种方法进行基因克隆的方式就是差异显示法基因克隆。l现在又出现了限制性消减杂交（SSH）和RNA任意引物PCR（RAD-PCR）等多种方法。2、目的基因重组质粒的构建质粒重组的基本步骤：从原核生物中获取目的基因的载体并进行改造；利用限制性内切核酸酶将载体切开，并用连接酶把目的

12、基因连接到载体上，获得DNA重组体。3、受体材料的选择、受体材料的选择（1 1）良好的植物基因转化系统应具有的条件：）良好的植物基因转化系统应具有的条件：高校稳定的再生能力；高校稳定的再生能力；受体材料要有较高的遗传能力；受体材料要有较高的遗传能力；具有稳定的外植体来源；具有稳定的外植体来源；对筛选剂敏感。对筛选剂敏感。（2 2）常用受体材料的类型：）常用受体材料的类型：l愈伤组织再生系统愈伤组织再生系统l直接分化再生系统直接分化再生系统l原生质体再生系统原生质体再生系统l胚状体再生系统胚状体再生系统l生殖细胞再生系统生殖细胞再生系统 4、转基因方法的确定和外源基因的转化（1）.载体介导转移系

13、统 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体携带将外源基因导入植物细胞并整合在核染色体组中随着核染色体组一起复制和表达。 主要方法有：叶盘法真空渗入法原生质体共培养法（2）.外源基因直接导入法 这是一种不需要借助载体介导，直接利用理化因素进行外援遗传物质转移的方法。 主要方法有：化学刺激法基因枪轰击法(gene gun )高压电穿孔法(electroporation)微注射法(microfibers )超声波介导法脉冲电泳法离子束介导法5、转化体的筛选和鉴定 1.转化体的筛选 2.转化体的鉴定 （1）DNA水平的鉴定 （2）转录水平的鉴定 （3）翻译水平的鉴定二、转基因作物的遗传特点n（一）

14、、外源基因整合机制1、同源重组整合（homologous recombination） 外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生交换替代，并整合到受体染色体组上。2、位点特异性重组（site-specific recombination） 在两条DNA的特异位点上，通过位点特异性重组酶的作用对DNA进行特异性切割，实现外源基因的整合。3、转座作用（transposition） 通过体外重组将外源基因插入到转座子系统中，当携带有目的DNA片段的重组转座成分复制并整合插入到染色体其他区域时实现外源基因的整合。4、异常重组（illegimate recombination） 异常重组整合

15、是外源基因整合到植物基因组的最常见方式。（二）、整合后的外源基因在植物体内的表现共抑制：向受体植物种导入一个与受体内某基因同源的基因，导入的基因及受体内与它同源的基因表达都可能减弱的现象。基因沉默：转基因植株由于外源基因的结构被破坏或者外源基因插入了染色体异染色质区域，出现外源基因序列不表达。(三)、外源基因在后代中的遗传规律分离类型家系数百分率 1各位点的整合（3:1）8152 2各位点的整合 不连锁（15:1）3221 连锁（3:1,15:1）96 3各位点的整合 不连锁（63:1）96 3各以上位点（255:1）53 例外（3:1）2013合计156100三、转基因作物品种的选育（一）、

16、转基因作物育种目标的制定（四）转基因作物的生物安全性第三节、分子标记辅助选择育种第三节、分子标记辅助选择育种n一、分子标记的类型和作用原理u1、分子标记的类型和特点u类型（按技术特性分类）Hibridisation-based markersHibridisation-based markers以分子杂以分子杂交为基础的交为基础的DNADNA标记技术（标记技术（RFLPRFLP标记、标记、DNADNA指纹技术、原位杂交指纹技术、原位杂交 ）PCR-based markersPCR-based markers以以PCRPCR反应为核心德反应为核心德DNADNA指指纹技术纹技术 （RAPDRAPD

17、标记、标记、SSRSSR标记、标记、SSLPSSLP标记、标记、SCARSCAR标记标记 、AFLPAFLP标记、标记、STSSTS标记标记 ）Sequencing based markersSequencing based markers新型的分子标记新型的分子标记（SNPSNP标记、标记、ESTEST标记标记 ） 2、原理和遗传特性(1)RFLP(1)RFLP标记标记A.RFLPA.RFLP标记的原理标记的原理 植物基因组植物基因组DNADNA上的上的碱基替换、插入、缺失碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生

18、增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态限制性片断长度多态性。性。基本步骤DNA提取提取用用DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化凝胶电泳分离，转移到滤膜上凝胶电泳分离，转移到滤膜上Southern杂交杂交 放射性自显影或酶学检测放射性自显影或酶学检测 nB、RFLP标记的特点标记的特点n （1）遍布于整个基因组，）遍布于整个基因组，n 数量数量 几乎是无限的；几乎是无限的；n （2）无表型效应，）无表型效应，n 不受发育阶段器官特异性限制；不受发育阶段器官特异性限制；n （3）共显性，）共显性，n 可区分纯合子和可区分纯合子和 杂合子；杂合子；n （4）结果稳定、可靠；）结果稳定、可靠；n （

19、5）DNA需要量大，检测技术繁杂，需要量大，检测技术繁杂， n 难以用于大规模的育种实践中难以用于大规模的育种实践中n（2）RAPD标记nA、 RAPD标记原理nB、 RAPD标记的特点n（3）AFLP标记nA、 AFLP标记原理nB、 AFLP标记的特点n（4）SSR标记nA、 SSR标记原理根据微卫星根据微卫星DNADNA两端的单两端的单拷贝序列设计一对特异引拷贝序列设计一对特异引物，利用物，利用PCRPCR技术，扩增每个技术，扩增每个位点的微卫星位点的微卫星DNADNA序列，通过序列，通过电泳分析核心序列的长度多电泳分析核心序列的长度多态性。态性。设计探针，筛选重组克隆设计探针，筛选重组

20、克隆根据根据SSRSSR两侧序列设计并合成引物两侧序列设计并合成引物 PCRPCR扩增反应扩增反应 建立基因组建立基因组DNADNA的质粒文库的质粒文库对阳性克隆对阳性克隆DNADNA插入序列测序插入序列测序凝胶电泳检测多态性凝胶电泳检测多态性B B、SSRSSR标记的特点标记的特点（1 1）SSRSSR标记为共显性标记，可鉴别出纯合子和标记为共显性标记，可鉴别出纯合子和杂合子。杂合子。（2 2）重复性高，稳定可靠。）重复性高，稳定可靠。（3 3）DNADNA用量少，对用量少，对DNADNA的质量要求也不太高。的质量要求也不太高。（4 4）使用）使用SSRSSR技术需要知道重复序列两翼的技术需

21、要知道重复序列两翼的DNADNA序列。序列。二、重要农艺性状基因连锁二、重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术标记的筛选技术（一）、遗传图谱的构建与重要农业性状基因的标记1、遗传作图的原理 其原理是基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置，并不反映DNA的实际长度。2、构建遗传图谱的主要环节：根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体。对群体中不同植株的标记进行基因性分析。借助计算机程序构建连锁群3、

22、构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。4、用于分子标记的遗传作图可分为两类：暂时性分离群体，包括F F2 2群体、BC等 永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等自花授粉作物作图群体的构建方法自花授粉作物作图群体的构建方法P PFFFFFB1:BCF PF PF PB2:BCDHL异花授粉作物作图群体的构建方法异花授粉作物作图群体的构建方法ABCDEfGABCDEfGAbcdEfgAbcdEfgAbCDEfGAbCDEfGaBCdefgaBCdefg杂合杂合F对对B、D、G位点来说，相当于位点来说，相当于F对对

23、A、C、E位点来说，相当于测交位点来说，相当于测交F位点不分离位点不分离F2F2BC1BC1DHDHRILRIL群体形成 F1自交后代F1回交后代F1花粉分化个体F2个体自交后代性状研究对象个体个体品系品系准确度低低高高必要的群体规模大大中中分离比例1:2:3或3:11:11:11:1（二）、近等基因系的培育与重要农（二）、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记艺性状基因的标记（三）、群体分离分析法与重要农艺、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记性状基因的标记（四）、数量性状基因的定位（四）、数量性状基因的定位三、作物MAS育种（一）、作物（一）、作物MASMAS育种须具备的条件育种须具备

24、的条件 u分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于求两者间的遗传距离小于5cM,最好最好1cM或更小。或更小。u具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，主要是应用段，主要是应用PCR技术。技术。u筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。易操作的特点。u具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。算机数据处理软件。供体受体 RR Rr rr (1-P)2P(1-P)

25、 PMRmrMRmr目标基因与目标基因与DNA标记间的遗传距离位标记间的遗传距离位p亲本中亲本中DNA标记的带型标记的带型F 杂种中杂种中DNA标记的带型标记的带型在在F 分离群体中分子标记类型分离群体中分子标记类型即即MM,Mm,mmMM类型的分子标记所代表的目标基类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率因型及其频率利利用用MAS的的遗遗传传基基础础（以（以RFLP为为例）例） M抗性标记抗性标记 R抗性基因抗性基因m感病标记感病标记 r感病基因感病基因（二）、（二）、MASMAS育种方法育种方法 1 1、回交育种、回交育种 2 2、SLS-MASSLS-MAS 3 3、MASMAS聚合育种聚合育种（三）（三）、提高分子标记的筛选效率提高分子标记的筛选效率n1、多重PCR方法n2、用相斥相分子标记进行育种选择n3、克服连锁累赘n4、降低MAS育种的成本