黑龙江省实验小鼠、大鼠遗传学质量调查-刘霄磊.docx

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1、黑龙江省实验小鼠、大鼠遗传学质量调査 刘霄磊，蔡文博，司昌德，曲连东，韩凌霞 (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，哈尔滨， 15001) 摘要目的根据最新颁布的国家标准，对黑龙江省的实验小鼠、大鼠的遗 传学质量进行调査。方法参照国家标准实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记 检测方法 GB/T 14927.1-2008,应用乙酸纤维素板，对来自 4个单位 JBALB/c 和 C57BL/6实验小鼠及 3个单位的 SD和 Wistar实验大鼠进行生化标记位点的 检测。结果被检的 BALB/c小鼠和大鼠中均存在杂合。结论大鼠符合封闭群 遗传概貌，但近交系小鼠出现了遗传漂变。 _ 关键词生化标记

2、；实验大鼠；实验小鼠 国家标准 Monitor of Genetic Quality of Mice and Rats of Heilongjiang Province Liu Xiao-lei， Cai Wen-bo, Si Chang-de， Qu Lian-dong， Han Ling-xia (Laboratory Animal Center of Harbin Veterinary Research Institute, CAAS , Harbin 150001) Abstract Objective To monitor the genetic quality of laborat

3、ory mice and rats in Heilongjiang Province in 2009. Method According to national standard of Laboratory animal-Genetic monitoring: methods for biochemical markers of inbred mice and rats GB/T 14927.1-2008， biochemical markers of mice of BALB/c, C57BL/6 strains and rats of SD, Wistar strains from dif

4、ferent sources were detected. Results The heterozygous locus of BALB/c mice and rats were appeared. Conclusion The rats in our province are in accordance with the genetic profile of closed colony animals. Genetic drift of mice from Unit3 may occur. Key words Biochemical marker; Rats; mice; National

5、standard 2009年 1月，国家颁布了改版后的近交系实验小鼠和大鼠的遗传学质量监 测推荐标 准实验动物 近交系小 鼠、大鼠生化 标记检测 方法 mGB/T 14927.1-2008。本研究根据新国家标准对黑龙江省 4个单位的小鼠和 3个单位的 大鼠进行了生化标记位点的检测。 1材料与方法 1.1实验动物 1.2仪 器设备与试剂 DYY-6C型稳压稳流电泳仪 、电泳 微量点样器和醋酸纤维板购于北京 六一仪 器厂，实验动物小鼠 、大 鼠遗传检测试剂盒购自中国药品生物制品 检定所 （批 号 :0903),检测所用生 化试剂均为分 析纯。 13样品的制备 按照国标制备样品。 取小鼠，摘眼 球采

6、血 ， 常规方 法制备血清和 5%柠檬酸 钠抗凝血 。将大 鼠逐放在通风橱十燥器内乙醚麻醉 ，至站 立不稳后取出。摘眼 球采血 ， 常规方法制备血淸和 5%柠橡酸钠抗 凝血。 将抗凝血离心 ， 500xg,离 心 5 min,弃 上 A在细胞压积内加入 4倍体积 （ v/v)的 蒸馏水 剧 烈震荡 1 min, 即 制备成溶血素 。另分别摘取忖脏、部 分小肠、部分 肺脏、 2侧苹丸 ，分 别在研 钵 屮研磨 ，转移在丨 .5 mL的 EP管中称 加 2 倍 ( v/m)蒸馏水混匀 ,4 C 2000xg 离心 30 min。 取上淸，立即检测 ，或在 -20 X：备存。 1.4各 同工酶的检测

7、 分别对小鼠相应组织 中的碱性磷酸嗨 -丨 （ Akpl)、 碳酸酐酶 -2 (Car2)、肾过 氧化氢酶 -2 (Ce2、 酯酶 -1 (Esl)、 酯酶 -3 (Es3)、 酯 _-丨 0 (EslO)、葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 -丨 （ Gpdl)、 葡萄 糖磷酸 异构酶 -1 (Gpil)、 血 红蛋白-p链 （ Hbb)、 异 柠檬酸 脱氢梅 -1 (丨 dhl)、 苹果酸 梅 -丨 （ Modi) 、肽 酶-3 (Pep3)、 磷酸葡萄糖 转位酶 （ Pgml)和 转铁蛋 n (Trf)等 14种同T酶进 行检测，大鼠相应组织中的 同工梅包括 Akpl、 血淸碱忡 磷酸酶 -1

8、(Alpl)、 过氧化鉍酶 -1 (Cs丨 ）、 Esl、 Es3、 酷酶 *4 (Es4)、 酯海 -6,8,9 (Es6,8,9)、 EslO和 Hbb等 11种的。同时设标 准品系 的组织样品， 作为带 型判定依据。 2结果 2.1小鼠检 测结果 2.1.1 Akpl的检测结果 来白送检单位 丨 #、 2#、 3#的全部个体都为慢带 ， b带型 ； 单位 4#的 全部个 体为快带， a带型。标样 CBA/N为 b带标样 C57BL/6为 a带型。送检单位 3#、 4#的检测结果见图 1。 图 1小鼠 Akp丨的检测结果 I, 12:标样 CBA/N: 2-丨丨：来自单位 3#: 13,

9、24:标样 C57BL/6: 1423:来 自单位 4#: Fig. 1 The results of Akpl detection in the mice 1,12: CBA/N ; 2-11: from Unit3 ; 13,24: C57BL/6 ; 14-23: from Unii4 2.1.2 Car2的检测结果 利用溶血索对 Car2位点进行检测 ，来 自送检单位 4#的全部 个体都为慢带 ， 判为 a带吧 .与标样 C57BL/6小鼠一致。其余个体与标样 BALB/c小鼠 致为 b 带型。 2.1.3 Ce2的检测结果 肾脏组织在 Ce2位点，带型有些模糊，但可以判断所打个体都为

10、 a带喂，慢 带，与标样 BALB/c小鼠致。 2.1.4 Esl的检测结果 以血淸为检测样品 ，以 CBA/N小鼠和 C57BL/6小鼠作为标样。来 6: CBA/N ; 7,18: C57BL/6 ; 8-17: from Unit4 Fig. 2 The results of Esl detection in the mice 2.1.5 Es3的检测结果 以 C57BL/6小鼠作为标样 （ a带型 )， 在 Es3位点，来自送检单位 丨 #、 2#、 4#的全部个体都为慢带， a带型：来自 3#的 4个个体（泳道 4、 7、 8、 10)为最 慢带， c带甩 ， 2个个体（泳道 6、

11、11)为 ac带型，其余个体为 a带璀。送检单 位 3#的检测结果见图 3。 I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1) 12 I, 12:标样 C57BL/6; 2 丨 丨：来自单位 3# 图 3小鼠 Es3的检测结果 1,12: C57BL/6; 2-11: from Unit3 Fig. 3 The results of Es3 detection in the mice 2.1.6 EsIO的检测结果 选川竹脏组织匀浆对 EslO位点进行检测，所有被检 个谇都 为慢带，为 a带 乳与标样 C57BL/6小鼠一致。 2丄 7 Gpdl的检测结果 选用肾脏组织匀浆对 Gpdl位点进行检

12、测 ，以 BALB/c小鼠和 C57BL7M、 鼠 作为标样。 来自中 .位 4#的个体为慢带， a带咁，与标样 C57BL/6标拃 致： K- 余送检单位 个体为 b带型，与标样 BALB/c 致。 2.1.8 Gpil的检测结果 S八届中国北方实验动物科技年会论文集 Gpil位点的 检测组 织为溶 血素在 ，来 自单位 4#的个体为快带， b带型 ，与 C57BL/6小鼠标样 一致； 其余送检单位个体为慢带， a带型，与 BALB/c小鼠标 样一致。 2.1.9 Hbb的检测结果 以溶血素加入 1/4体积的烷化剂来检测 Hbb位点，标样 BALB/c为 d带型， 标样 C57BL/6为 s

13、带型，来自送检单位 4#的个体为快带， s带型； 其余送 检个体 为慢带 ， d带型。 2.1.10 Idhl和 Modi的检测结果 利用肾脏组 织对丨 dhl和 Modi位点进行 了检测 。所 有被检样品在 Idhl位点 都为 a带型，慢带。在 Modi位点，只冇单位 4#的个体为 b带型，与标样 CBA/N 致；其余中 .位个体为 a带型，与标样 BALB/c 致。 2.1.11 Pep3的检 测结果 肽酶 -3为 新国标中增加的位点 ，利用 肾脏组织检测 。带型不是十分明显，所 有被 检样品与标样 C57B176小鼠 一致， a带甩，慢带。 2丄丨 2 Pgml的检 测结果 以 C57B

14、L/6小鼠 为标样 （ a带型 )， 利用 肾脏匀 浆进行 Pgml位点的检测，4 个单位 的被检个体都为快带， a带型。 2.1.13 Trf的检测结果 Trf位点利用血清样品进行检测，所有 被检个体都为 慢带， b带型。标 样C57BL/6为 b带型。送检单位 2#、 3#的检测结果见图 4。 I 7 4 S ; r, 7 8 9 10 II 12 13 L4 15 16 17 18 19 20 21 22 23 1, 12, 23:标样 C57BL/6: 2-11:来自单位 2#: 13-22: 来自单位 3# 图 4小 RTrf的检测结果 1,12,23: C57BL/6 ; 2-11

15、: from Unil2 ; 13-22: from Unit3 Fig.4 The results of Trf detection in the mice 2.2大鼠检测结果 2.2.1 Akpl的检测结果 利用肾脏组织对 Akpl位点进行检测，以 WKY大鼠作为标准样品 （ b带型 ), 结果表明所有被检样品都缺失一条带，出现明显 b带型，带型清楚。 2.2.2 Alpl的检测结果 以血淸为检测样品，以 DA大鼠和 BN大鼠作为标样。 DA大鼠表现为快带 , a带型：标样 BN大鼠为慢带， b带型。所有被检样品都为慢带， b带型。见图 6。 第八届中国北方实辁动物科技年会论文集 1 2

16、3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 1 2 1 3 14 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 22 2 3 2 4 b带一 a带 1-5:来 6单位 5#: 6, 18:标样 DA: 7. 19:标样 BN: 8-17: 来自笮位 6#; 20-24:来自单位 7# 图 5大鼠 Alpl的检测结果 1-5: from Unii5 ; 6,18: DA; 7.19: BN ; 8-17: from Unit6 ; 20-24: from Unit7 Fig. 5 The results of Alpl detection in the rats 2.2.3 Csl的检

17、测结果 溶 血素在 Csl位点，所 有被检 样品均出现了 快带， 与标样 BN大鼠一致的 a 带型。 Es丨和 Es3的检测结果 利 用小肠组织对 Es丨和 Es3位点进行了检测。其中送检中 .位 5#中 1个个体 (泳道 2)、 单位 7#全部个体在 Esl位点为 a带甩，而且存在明显表达量的差异， 其余个体为 b带型。在 Es3位点，送检单位 5#屮 4个个体 （泳道 1-4)、 单位 6# 中 1个个体（泳道 9)、 单位 7#全部个体 为快带 a带塑 ，其余个体为 c带型。标 样 F344/N在 EsI和 Es3的带型 均为 a:标样 BN在 Es丨和 Es3的带型 分别为 a 和 d

18、:标样 SD的分别为 b和 c。 如箭头所示，见图 7。 1-5:来 0 单位 5#; 6. 24:标样 F344/N: 7: 标样 BN: 8:标样 SD: 9-18:来 H承位 6#: 19-23:来 1*1 单位 7# 图 6大鼠 Esl和 Es3的检测结果 1-5: from Unit5 ; 6,24: R44/N ; 7: BN ; 8: SD ; 9-18: from Uni(6 ; 19-23: from Unit7 Fig. 6 The results of Esl and Es3 detection in the rats 2.2.5 Es4的检 测结果 利用肾脏 组织对 E

19、s4位点进行了检测，结果 所有被 检组织 都出现 3条慢带 ， 为 b带型，与标样 WKY大鼠一致。 2.2.6 Es6,8,9的检 测结果 结 果表明 ，送检中位 5#中丨个个体 （泳道 5)带型为 Es6-a、 Es8-a、 Es9-a, 其 :余全部 个体带 型均为 Es6-a、 Es8-b、 Es9-a。 如箭头所示，由上至下分别代表 Es6、 Es8和 Es9的带型 。标样 SHR的结果为 标样 WKY 为 Es6-a、 Es8-a、 Es9-c。 2.2.7 EslO的检测结果 肺脏样品在 EslO位点出现 3条慢带，均为 a带型，与标样 F344/N 致。 2.2.8 Hbb的检

20、测结果 以溶血素加入 3倍体积 （ V/V)的 6 mol/L尿素为检测样品。结果表明，所 有被检样品在 Hbb位点缺失一条带，均为 b带型，与标样 LEW/M 致。 3讨论 2 9年的我省实验小鼠、大鼠遗传学监测使用的方法为新颁布的国家标准 实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法 GB/T 14927.1-2008。新的 国标在近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法中的电泳结果模式图基础上，增加电 泳图谱，彩色图片的增加使检测结果更加容易判断；调整了近交系小鼠、大鼠生 化标记检测方法中的部分生化位点，小鼠增加了肽酶 -3 (pep3)位点，大鼠增补 血清碱性磷酸酶 （ Alp)和血红蛋白 （ H

21、bb)两个生化位点；对部分溶液配方进 行调整。由于检测样品数量比较多，试剂 盒没有及时到位，一部分样品保存的时 间有些长，所以在使用试剂染色的时间相对延长了，一些位点的带型不是特别清 晰，但不影响检测结果的判断。 相对于实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法 2GBnM4927.2-2008、 形态学方法、 DNA多态性检测法等 3_6方法，生化标记方法在中国应用的时间较 长。所以，应用生化标记方法检测实验动物得出的结果清晰，明确，较为理想， 快速 本研究参照实验动物生化标记检测方法的国家标准 1i，分别对 4批送检小鼠 相应组织中的 14种同工酶、 3批送检大鼠的 1 种同工酶的表达情况进行

22、了检测。 检测结果发现，小鼠：来自送检单位 3#的小鼠，在酯酶 -3检测中出现杂合型位 点，该品种可能发生遗传漂变；其余单位小鼠未发现遗传变异，为合格品系。大 鼠：来自送检单位 5#的大鼠在 Esl位点存在 a、 b两种带型，在 Es3位点存在 a、 c两种带型，在 Es8位点存在 a、 b两种带型；来自单位 6#的大鼠在 Es3位点存 在a、 c两种带型；其余个体之间存在一定表达量、迁移率等差异，体现了封闭 群的杂合特点 与 2008年黑龙江省实验大鼠遗传学检测 m相比 ，黑龙江省实验小鼠、大鼠 的饲养品种没有增加，但饲养量有所增加，这说明我省在实验动物的需求量在逐 渐增加。封闭群实验大鼠仍

23、保持着封闭群的杂和特点，为科学研究提供了良好的 资源。 参考文献 1 GB/T 14927.1-2008实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法 S. 2 GB/T 14927.2-2008实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法 S. 3 李军林，张耀光，魏涨 .近交系小鼠的遗传监测 J.动物医学进展 ,2001, 22(2)： 42-44. 4 李瑞生，陈振文，栾蓉晖，等 .近交系大鼠微卫星 DNA与生化标记分析 的比较研究 J.中国实验动物学杂志， 2002, 12(4): 225-228. 5】王洪，岳秉 L刘双环，等 .BALB/c小鼠遗传质量检测的新方法 J.中 国比较医学杂志， 2008, 18(6): 54-59. 6 刘秀英，胡怡秀，黄跃龙，等 .近交系大、小鼠遗传检测方法研究进展 J.实用预防医学， 2008, 15(6): 1993-1996. 7 韩凌霞，刘霄磊，牛成明，等 .黑龙江省实验大鼠遗传学概貌分析 . 中 国比较医学杂志， 2010 , 20(2): 48-50.