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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date论文格式模板(例文)论文格式模板(例文)论文编号： 贵阳护理职业学院2014届高职高专学生毕业论文Noggin、BMP2和IGF-I对成骨细胞生长的调节作用系 别： 专 业： 指导老师： 学 生： 中国贵州贵阳 2013 年 6 月目 录中文摘要IV英文摘要V 前 言11. BMP蛋白21.1 BMP结构和功能21.2 BMP诱导成骨机制22. Noggin基因的概况

2、32.1 Noggin基因的结构32.1.1 Noggin基因结构特征4 结 果25致 谢51参 考 文 献52中文摘要目的：研究noggin、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）、胰岛素样生长因子I（insulin like growth factor I，IGF-I）对成骨细胞增殖和分化的调节作用。方法：1、将人成骨肉瘤细胞MG63于RPMI 1640培养基中培养，添加不同浓度的noggin、BMP2、IGF-I蛋白进行药物干预，用四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyl-tetrazolium，MTT）法研究细胞的增殖率。2、选用最

3、适浓度的noggin、BMP2、IGF-I蛋白作用成骨细胞，运用ELISA方法和RT-PCR技术分别检测成骨细胞分化标志物骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase, BALP）和骨钙蛋白（osteocalcin, OC）的蛋白含量和mRNA的表达情况。结果：1、各药物干预组OD值与对照组相比有统计学差异（P0.05），对成骨细胞增殖的作用效应呈剂量和时间依赖性，其作用的最佳时间均在72h。各药物组内之间比较，确定了最佳作用浓度，BMP2为210-9 mol/L，对MG63细胞的增殖率达179.59；noggin为810-9mol/L，对其增殖的抑制率达到15.51；IG

4、F-I为110-8mol/L，其增殖率达189.80。结论：BMP2、IGF-I对MG63细胞增殖有促进作用，而noggin则抑制MG63细胞的增殖。Noggin、BMP2和IGF-I促进BALP的分泌。Noggin对OC蛋白的分泌有抑制作用，而BMP2、IGF-I则促进OC蛋白的分泌。关键词：Noggin蛋白，BMP2蛋白，IGF-I蛋白，成骨细胞，增值，分化英文摘要Object: The aims is to study the effects of noggin, bone morphogenetic protein 2 (BMP2) and insulin-like growth fa

5、ctor I (IGF-I) on the proliferation rates and differentiation of osteoblasts.Methods: The human osteosarcoma cell line MG63 were chosen using the RPMI1640 medium with 10 fetal bovine serum (FBS). Then, the cultured MG63 cells were exposed to BMP2, noggin and IGF-I at different concentrations with ze

6、ro concentration as control group (CON). Ability of the proliferation of MG63 cells was detected by methylthiazolyltetrazolium method (MTT). the concentration of BALP and OC of osteoblasts were determined by ELISA method.at different time points (12h, 24h, 48h, 72h) after optimal dosage of noggin BM

7、P2, IGF-I were added into the culture medium.And the expression level of BALP and OC were investigated by reverse transcription PCR at the same time.Results: 1. The proliferation ability of MG63 cells treated with BMP2, noggin and IGF-I groups were significantly different compared with that of CON g

8、roup(P0.05). The effects of three factors on MG63 cell was dose-dependently and time-dependently after cultured for 72h. The most effective growth of MG63 cells showed at 210-9 mol/L of BMP2 with the proliferation rate of 179.59 and 110-8mol/L of IGF-1 with the rate of 189.80, while 810-9mol/L noggi

9、n with the inhibitory proliferation rate of 15.51, respectively. 2. The concentration of BALP treated with BMP2, noggin and IGF-I groups were significantly different compared with that of CON group (P0.05) for 48h, especially, the noggin group was extremely significant (P0.01), and the BALP mRNA exp

10、ression were also significantly different (P0.05). 3. The concentration of OC treated with noggin groups were significantly different compared with that of CON group (P0.01) for 24h, but the OC mRNA expression were not significantly different (P0.05). The concentration of OC of BMP2 group were signi

11、ficantly different compared with that of CON group significantly different compared with that of CON group (P0.01) , and the OC mRNA expression were also significantly different (P0.05). The concentration of OC of IGF-I group were significantly different compared with that of CON group significantly

12、 different compared with that of CON group (P0.01), and the OC mRNA expression were also significantly different (P0.05).Conclusion: BMP2 and IGF-I promoted the proliferation of MG63 cells whereas noggin inhibited. Noggin, BMP2, and IGF-I enhanced the concentration of BALP in osteoblasts. BMP2 and I

13、GF-I improved the concentration of OC in osteoblasts, whereas noggin inhibited.Key words: Noggin; bone morphogenetic protein 2 (BMP2); insulin-like growth factor I (IGF-I); MG63 cell; proliferation; differentiation.- 前 言生长是动物个体发育特有的生理特点，其主要表现在体高体长的增长方面。而体高体长的增长则源于骨骼的纵向生长，从而形成相应的骨骼系统，达到体高体长的增长的目的。骨骼系

14、统也是机体非常重要的一个组成部分，它支撑躯体，保护内脏，并且和骨骼肌一起协调配合完成其运动功能。 在骨骼的生长发育过程中，骨组织不断进行着新骨形成和旧骨吸收的骨重建过程，即骨形成（bone formation）与骨吸收（bone resorption）的动态平衡代谢过程。骨形成由成骨细胞介导来完成。在骨形成过程中，成骨细胞主要经历细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和细胞凋亡四个阶段。在幼年生长时期，骨形成远远大于骨吸收（Krupa B et al, 2005），为骨骼的生长提供了良好的基础，也为体高体长的增长提供了重要的保证。在成年时期，骨的形成较为稳定，骨骼的生长不再发生变化，这主要是

15、受到骨形成与骨吸收相对均衡的一个动态调节作用来完成。在晚年时期，则主要趋向于骨吸收大于骨形成，从而骨形成会受到一定的影响，这将导致一系列骨疾病的发生，比如在老年人群体中常出现的骨质疏松症。 然而骨骼的纵向生长是一种十分复杂的过程，是多种内分泌激素、生长因子在时空上对生长板综合作用的结果。内分泌系统的全身性激素如生长激素、降钙素、甲状旁腺激素、性激素、糖皮质激素等，与生长因子如胰岛素样生长因子-（Iinsulin-like growthfactor-I，IGF-I）、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、转化生长因子(transforming gro

16、wth factor TGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactors，FGF)、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、甲状旁腺素相关肽（PTH-related peptide，PTHrP）等局部因子，以及外源性物质如维生素D等相结合，共同调节骨骼生长过程。1. BMP蛋白(一级标题)1.1 BMP结构和功能（二级标题）在1965年，Urist首次发现骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP) ，BMP属于转化生长因子-(transforming growth facto

17、r-) 超家族的一员，具有诱导骨形成的作用，现已发现其家族至少有20多个成员。BMP是一种低分子量酸性多肽，属于二硫健交联的生长和分化因子（Wozney JM等，1998）。是结构类似的高度保守的功能蛋白质族，其C-端有一个高度保守的结构域，内含7个位置稳定的半肤氨酸，这对于形成正确的二聚体结构有重要意义。研究发现，BMP的活性形式为二聚体，它既可以两个相同的链形成的同源二聚体起作用，也可以两个不同的链形成的异源二聚体起作用。BMP合成时是一个大的前体蛋白，包括一个信号肤部分，一个前结构域及一个羧基末端区。当羧基末端区经蛋白水解酶作用从前体蛋白上释放出来时，二聚体即开始形成，它释放到细胞外与机

18、体各处靶细胞表面的相应受体结合而发挥作用。BMP家族成员都通过结合两种丝氨酸/苏氨酸激酶跨膜受体（即BMP型和型受体）发挥其生物学活性功能（Miyazono K et al, 2001）。研究发现，BMP之间可与不同的受体结合，表现信号传递的多样性。正是同一种BMP可结合几种不同的型受体，所以才表现出具有调节细胞趋化、增生、分化、迁移和凋亡等多种功能（Mehler MF et al, 1997）。例如，BMP与合适的受体结合，能够在体内、体外诱导未分化的间充质细胞向软骨、骨细胞发生不可逆的分化，形成软骨和骨组织（Barboza E et al, 1999）。1.2 BMP诱导成骨机制（二级标题

19、）BMPs是由多组单位构成的复合物。据研究报道，能够对成骨前体细胞MSCs的成骨分化作用主要有BMP2、6、9三种BMP蛋白，而其它的BMP则对成熟的成骨细胞的有作用，其中BMP2被认为是活性最强的唯一能单独诱导成骨的因子（Wozney JM et al, 1998）。研究发现BMP作为一种强骨诱导活性的生长因子，能够启动MSCs的成骨过程（Wu X et al, 1996）。BMP对MSCs分化促进作用，主要是增加细胞内BALP活性，提高胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥素的表达。这可能是因为MSCs中有较多的未分化细胞，BMP与该细胞膜表面特异的膜受体结合，通过信号转导途径，激活细胞相应基因表达促进

20、成骨作用的蛋白。Gazze研究发现BMP降低细胞内的胶原酶mRNA的表达，利于细胞外基质的合成（Gazzerro E et al, 1999）。跨膜丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶是BMP的受体，BMP的诱导机制控制着成骨过程的趋化、有丝分裂及分化三个关键步骤（Reddi AH et al, 1995）。骨诱导是指一种组织或其产物能使第二种组织分化成骨的过程。诱导成骨需具备三个条件（Stone CA等，1997； Reddi AH等，2000）：（l）存在诱导因子，当某些部位BMP浓度达到一定程度，就可以诱导骨生成。（2）存在BMP的靶细胞群，即骨髓中存在诱导性成骨细胞（IOPC）和定向性成骨细胞（DO

21、PC）（Reddi AH et al, 1995），前者需要分子信号诱导分化，而后者可以自行分化为成骨细胞。诱导性成骨细胞是作为BMP靶细胞。体外研究表明BMP靶细胞还有：结缔组织中未分化而有活力的间充质细胞、骨膜基质细胞、骨膜细胞（Bostrom MP et al, 1993；Bosch P et al, 2000）。（3）存在允许骨生长的正常环境。BMP诱导成骨包含有3阶段，每一阶段都具有多分子放大效应（Reddi AH et al, 2000）：（1）诱导趋化，是指细胞响应化学信号分子浓度变化所做出的方向性移行，在BMP趋化作用下，血浆纤维连接蛋白与产胶原的骨基质连接，促进间充质细胞黏附

22、其上发生增殖。天然牛BMP3和BMP4在体外可以直接趋化血中单核细胞（Reddi AH et al, 1995）。趋化性与BMP浓度及细胞上的受体密度有关；（2）诱导有丝分裂，细胞通过有丝分裂得到增殖；（3）诱导分化，BMP可以诱导成纤维型细胞分化为成骨型细胞。BMP在诱导软骨化骨时伴有I型胶原和II型胶原，碱性磷酸酶基因表达。2. Noggin基因的概况（一级标题）2.1 Noggin基因的结构（二级标题）2.1.1 Noggin基因的结构特征（三级标题） 在1992年，California大学的Harland，R.M.和Smith，W.C.从非洲爪蟾的胚胎中分离出noggin基因，在人的体

23、内定位于染色体17q22，在大鼠与小鼠体内定位于11号染色体。Noggin cDNA编码产物为26kD的蛋白，具有疏水氨基末端，是一种分泌蛋白。 Noggin基因编码的蛋白序列具有高度的保守性，人类noggin的氨基酸序列与爪蟾、小鼠、大鼠、兔子、马具有高度的同源性。它对胚胎和个体发育有着重要的作用，如神经管的形成和关节软骨的形成。结 果实验采用MTT法主要基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解，产生紫兰色结晶状颗粒，其量与活细胞数呈正比，也与细胞的活力呈正比，因此本文应用MTT法测定MG63细胞增殖活性的变化。运用外源BMP2蛋白干预MG63细胞的增殖，结果显示，BMP2蛋白能够直接

24、促进MG63细胞的增殖，呈表现出剂量和时间依赖性，浓度为210-9 mol/L作用72h时增殖率最高，为179.59。与本文的研究结果不同，其他学者的研究结果（Kuo PL et al, 2006）显示，100ng/ml的BMP2作用48h对MG63细胞没有增殖作用，显然本文使用的有效浓度更低。在体外，外源BMP2直接刺激成骨细胞的形成和成熟，是成骨细胞增殖、分化和形成的有效促进物。研究证实（王军琳等，2004），外源BMP2蛋白能够显著诱导周期蛋白CDK4表达的增加，促进细胞的增殖。因为细胞周期蛋白D在细胞G1期进程中控制着G1期的时间，CDK4 （或CDK6）作为催化亚基与其结合形成复合物

25、构成全酶发挥作用，促使细胞越过限制点，完成G1期向S期时相的转换。成纤维细胞中cyclinD1过度表达导致G1期缩短，提前进入S期，细胞体积小并丧失对外源性增殖分裂信号的响应。Cyclin D1和CDK4在肿瘤细胞的细胞周期循环中出现障碍时，Cyclin D1表达产物的堆积将使肿瘤细胞的G1期缩短，引起细胞的过度增殖（Sherr CJ，1996）。外源性noggin蛋白对MG63细胞的增殖具有明显的抑制作用，并存在明显的时间和浓度依赖性，浓度为810-9mol/L作用72h时对MG63细胞增殖的抑制率达到15.51。应用浓度为1g/ml时noggin（康健等，2009），对MG63细胞的抑制率

26、为15.30%，相比之下，本文应用的noggin有效浓度更低，之间的差异可能与胎牛血清中的干扰因子有关。在培养基中添加胎牛血清的同时也将其中的BMPs等因子带入（马忠仁等，2003；李巍等，2003），可能会对noggin蛋白的作用造成一定的干扰。noggin对细胞增殖的抑制作用，主要通过抑制BMPs实现的。Noggin是BMPs的特异性拮抗剂，可与BMPs结合形成较大的戒指样结构，遮蔽了BMPs上的受体结合位点，从而抑制BMPs与其受体结合（Zehentner BK et al, 2002）。在动物骨的形成过程中，noggin主要拮抗BMP2的作用，本文的研究结果也显示，BMP2对成骨细胞的

27、增殖起直接的促进作用，本文在加入noggin因子之前，以无血清的牛血清白蛋白代替胎牛血清对MG63细胞进行饥饿培养，消除了胎牛血清带入BMPs等干扰因子的影响。本文的研究结果显示，外源IGF-I蛋白对MG63细胞增殖有直接的促进作用，且存在浓度和时间依赖性。IGF-I在110-8mol/L作用72h时的增值率最高，为189.80，与已知结果基本一致（Langdahl BL et al, 1998）,IGF-I刺激成骨细胞的DNA和RNA的合成，促进细胞的生长、增殖及分化，以自分泌和旁分泌的形式调节骨骼细胞的功能，影响骨的形成，并抑制小鼠成骨细胞的凋亡（Hill PA et al, 1997）。

28、与相同浓度的BMP2相比，IGF-I的作用较强，提示成骨细胞的增殖主要受IGF-I的调节。骨骼纵向生长过程是以生长板为中心的骨形成与骨吸收的动态平衡过程。在机体的生长发育过程中，骨形成大于骨吸收，因此新骨不断形成，骨干加长，从而实现骨骼的纵向生长。成骨细胞介导骨的形成。骨碱性磷酸酶（BALP）和骨钙蛋白（OC）是成骨细胞在不同分化阶段的代谢产物。骨组织形成经过两个步骤，首先是形成类骨质（osteoid），然后类骨质矿化（mineralization）为骨组织。成骨细胞分泌骨基质的多种有机成分，包括骨碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、蛋白多糖、骨钙蛋白等构成类骨质。胶原蛋白与粘多糖构建骨盐沉积的支架。成

29、骨细胞向类骨质中释放富含碱性磷酸酶和钙结合蛋白的基质小泡。在碱性磷酸酶作用下，类骨质矿化成为骨基质。类骨质矿化是无机盐有次序地沉积于类骨质的过程，其中最关键的是无定形的磷酸钙形成羟基磷酸灰石结晶。钙离子和磷离子是矿化的基本物质，钙离子和磷离子形成羟基磷酸灰石结晶。骨钙蛋白（OC）具有钙离子结合位点，通过骨钙蛋白的钙离子结合位点将羟磷灰石吸附沉积到胶原蛋白和粘多糖构成的骨架上，从而完成矿化过程，有机物和无机物紧密结合起来，使骨骼得到生长。本文对BALP蛋白含量和mRNA表达水平的研究结果表明，从BALP蛋白含量水平看，在作用48h时，noggin蛋白、BMP蛋白和IGF-I蛋白对能显著增加成骨细

30、胞培养液中BALP的蛋白含量（P0.05），noggin蛋白的作用最强（P0.01）。BALP的显著增加，导致类骨质矿化成为骨基质的作用得到加强，为其骨组织的形成做准备。运用RT-PCR检测各实验组中BALP mRNA的相对表达量，结果显示，在48h时，noggin蛋白、BMP2蛋白和IGF-I蛋白增加BALP mRNA的表达量（P0.01）。这些结果提示，成骨细胞BALP蛋白含量主要受BALP基因表达水平的调控。骨钙蛋白（OC）是成骨细胞在分化过程中释放的非胶原蛋白，是骨质钙化、矿化必需的因子，是骨细胞分化终末阶段出现的标志。从24h开始，noggin组成骨细胞培养液中OC蛋白的含量较对照组

31、低（P0.01），对OC mRNA表达的影响则不大（P0.05），说明noggin对OC蛋白水平的影响，noggin可能主要抑制OC蛋白的释放，对其基因的表达影响不大。BMP2能极显著地增加细胞培养液中OC蛋白的含量（P0.01），同时，也能促进OC mRNA的表达，提示BMP2对OC蛋白的合成和释放都有促进作用。IGF-I作用于成骨细胞后，其OC蛋白水平上升（P0.01），但抑制OC mRNA的水平（P0.05），其原因有待进一步分析。致 谢光阴荏苒，岁月如梭。不知不觉三个春秋已匆匆而过，时值本文完成之际，回首贵大数载，收益良多，感慨万千，因为在我的生命中有那么多可亲可敬可爱的人值得感激。

32、作者：参 考 文 献1 马忠仁，冯玉萍，李倬，乔自林，侯兰新，李明生，冯若飞动物血清在细胞培养中的重要性及其质量控制标准J西北民族大学学报（自然科学版），2003，24（3）：56-592 王军林，刘源，金岩RhBMP-2对舌癌细胞Tca8113 增殖能力影响的研究J实用口腔医学杂志，2004，20（2）：186-188.3 李巍，李成仁，蔡文琴，姚忠祥胎牛血清对人胚胎神经干细胞分化的影响J第三军医大学学报，2003，25（1）：4-6.4 金由辛，刘建华，金言RNA分离与鉴定实验指南M北京，化学工业出版社，2008年，108-101.5 高珊，毛萌胰岛素样生长因子与生长发育的研究进展J国外医

33、学儿科学分册，2004，31（5）：269-271.6 康健，苟三怀，曹东 Noggin蛋白对人骨肉瘤细胞MG63增殖的影响J 生物骨科材料与临床研究，2009，6（3）：41-44.7 章静波，方瑾，王海杰，谭玉珍 精编细胞生物学实验指南M北京，科学出版社，2007年，3-10.8 黄培堂译分子克隆实验指南（第三版）M北京，科学出版社，2005年，877-881.9 Barboza E, Caula A, Machado F. Potential of recombinant human bone morpho- genetic protein-2 in bone regeneration.

34、 Implant Dent, 1999, 8(4): 360-367.10 Bostrom MP, Lane JM, Berberian WS, Missri AA, Tomin E, Weiland A, Doty SB, Glaser D, Rosen VM. Immunolocalization and expression of bone morphogene-tic prote 2 and 4 in fracture healingJ. J Orthop Res, 1993, 13(3): 357-367.11 Bosch P, Musgrave DS, Lee JY, Cummin

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36、ol Int, 2000, 19(6): 205-208.13 Farley JR, Stilt CB. Apoptosis may determine the release of skeletal alkaline phospatase activity from human osteoblast-line cellsJ. Calcif Tissue Int, 2001, 68(1): 43-52.14 Feeley BT, Liu NQ, Conduah AH, Krenek L, Roth K, Dougall WC, Huard J, Dubinett S, Lieberman JR

37、. Mixed metastatic lung cancer lesions in bone are inhibited by noggin overexpression and rank: Fc administrationJ. J Bone Miner Res, 2006, 21(10): 1571-1580. 提示：论文中的表格要用三线表格论文中表的格式如下：表3.1 各药物组对成骨细胞增殖功能的影响Tab.3.1 The effect of noggin, BMP2, IGF-I on osteoblasts proliferation组 别 浓 度时 间（h）24487296BMP2

38、110-90.222 0.0060.401 0.0030.606 0.0590.295 0.044210-90.399 0.0100.406 0.0080.685 0.0100.443 0.040410-90.238 0.0120.402 0.0070.582 0.0330.301 0.007Noggin210-90.203 0.0050.222 0.0080.218 0.0030.221 0.004410-90.214 0.0060.224 0.0060.229 0.0020.222 0.016810-90.191 0.0040.212 0.0050.207 0.0050.231 0.006

39、IGF-I110-90.313 0.0290.551 0.0140.617 0.0050.312 0.015110-80.521 0.0020.593 0.0090.710 0.0150.519 0.004210-80.340 0.0260.515 0.0170.601 0.0140.383 0.061对照组0.215 0.0080.235 0.0130.245 0.0120.237 0.018缩 略 词英文缩写英 文 全 称中文全称AMPampicillin氨苄青霉素BMP2bone morphogenetic protein 2骨形成蛋白2bpbase pair碱基对bFGFbasic f

40、ibroblast growth factor碱性成纤维细胞发生因子BALPbone alkaline phosphatase骨碱性磷酸酶BSABull serum albumin牛血清白蛋白cDNAcomplementary DNA互补DNADEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMSOdimethyl sulfoxide二甲基亚砜EDTAethylene diamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸FBSFetal Bovine Serum胎牛血清hBMSChuman bone marrow mesenchymal stem cells人骨髓基质细胞IG

41、F-insulin-like growth factor-胰岛素样生长因子-IGFBPinsulin-like growth factor-binding protein类胰岛素生长因子结合蛋白Kbkilo bases千碱基KDakilo Daltons千道尔顿molmolar摩尔mlmililiter毫升mRNAmessenger RNA信使RNAMEMMinimum Essential MdudmMEM培养基MOPS3-N-morpholinopropanesulfonic acid3-(N-吗啡啉) 乙磺酸MTTmethylthiazolyl-tetrazolium四甲基偶氮唑盐OCosteocalcin骨钙蛋白ODoptical density光密度PBSphosphate buffer saline磷酸盐缓冲液PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应RNAribonucleic acid核糖核酸SDSsodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠lmicroliter微升