人参组织培养的研究现状及展望.doc

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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date人参组织培养的研究现状及展望人参组织培养的研究现状以及展望人参组织培养的研究现状以及展望摘要 人参作为一种传统珍贵中革药，其药用价值早已在西方获广泛认可，世界市场日益扩大。目前种植是人参供给主要来源，但既缓慢费力又易受气候和病虫害等环境严重影响，植物细胞组织培养是大量生产人参及其生物活性物质的一种有效方法。人参细胞和组织培养始于60年代初、80年代束在日本开始其商业化

2、应用。近几年来，人们还在不断努力研究和发展人参细胞培养技术，目的在于进一步提高其培养效率以获粹曼广的实用化。本文主要介绍近年来人参细胞培养方面的一些进展，着重阐述人参愈伤组织培养、人参细胞悬浮培养、人参体细胞胚胎培养、人参毛状根培养、人参不定根培养等方面人参组织培养的研究进展。关键词 人参；组织培养；研究现状；愈伤组织；悬浮细胞；体细胞胚胎；毛状根；不定根；展望前 言人参(五茄科人参属)是一种最有价值的贵重药用植物之一。从古时起，在中国、日本和韩国等，人参(主要是其干燥块根)就已用作治疗用药和保健补品。据报道，人参对人体健康有许多有益的作用，如抗肿瘤、抗衰老、消除紧张和增强人体免疫功能，但这些

3、只是已被临床确证的一小部分(TangEisenbrand，1992l。近年来，人参作为种强身健体的补品被不断用于各种商业化保健品，包括人参胶囊、饮料、补酒和化妆品覆盖许多国家。据统计世界上光各种人参原材料的年销量已达到10亿美元。另外，人参的药用价值引起了全世界的广泛兴趣，现在人们仍在不断考察人参的药理作用和鉴别新的生物活性物质(Y5 Lee，et a1，1997；YS Lee eta1，1997：See el：a1，1997)。到目前为止，己报道人参中含有皂甙、抗氧化剂、多肽、多糖、脂肪酸、醇类和维生素等(Huang，1993)，其中的皂甙是主要的活性成分。从前，人参是一种野生植物，只在韩国

4、和中国东北的一些地区发现有人参生长。现在，野人参已很难获得，市场上的人参大多是人工栽培的人参。人工栽培既耗时又耗力，从播种到最终收获需57年时间，并且在此期间由于人参生长受土壤、气候、病菌和害虫的影响，需要经常照料(Sticher，1998：Proctor，1996)。植物细胞培养生产人参和其活性成分如人参皂甙是一种潜在的更有效的方法。用细胞培养的方法，产品的质量和产量宜于控制，不受季节性气候和地理环境等因素的限制，而且培养条件和操作变量更易最优化。因为细胞从植株生产力最高的部分筛选得到，因此细胞培养可获得更高的生物活性物产量并具有更好的选择性。事实上日本的日东电工公司已进行人参的商业化，生产

5、规模达到了20|t左右(Ushiyla，1991：UshiyamaHibino，1997)。中国和韩国是人参的主要生产国和消费国，包括中国和韩国在内的一些国家虽然对有关人参培养过程进行了广泛考察但未见其商业化报道。本文中，介绍了近几年人参细胞培养的最新研究开发动向，综述了人参组织培养的主要研究成果，为人参资源的研究提供参考。1 人参愈伤组织培养的研究可用于诱导人参愈伤组织采用的外植体主要是人参的根、茎、叶片、叶柄、花药、花丝、子房、果肉、原生质体等，以根和茎作为外植体最为常见。早在1964年，中国科学院植物生理研究所罗士韦教授先采用人参根为外植体，培养于改良的Heller培养基中形成了愈伤组织

6、，继代培养移植4次取得成功1。1968年，Butenko等成功从人参叶柄、叶片、花冠柄和根的外植体上诱导出愈伤组织。随后，美国、日本、印度、朝鲜等国家相继开展了人参组织培养的研究，促使人参愈伤组织培养的研究在全球开展起来。朱蔚华教授等2报道不同培养基上人参愈伤组织诱导频率和生长速度的不同。人参愈伤组织适宜的培养基为附加10的whise、Ms、修改FOx，其中以修改FOX培养墓愈伤组织诱导率最高，愈伤组织生长速度以SH培养基最快。而人参愈伤组织诱导和培养用得最多的培养基是MS基本培养基，采用MS、N6、B5、Blaes、I、F0x和修改Ms等培养基均能获得愈伤组织。大量研究集中在植物生长调节剂对

7、人参愈伤组织培养各阶段调节作用。古谷力3研究证实，2，4-D的最适浓度为052 mgL-1叫对人参愈伤组织的诱导具有良好的效果。朱蔚华等4H指出：适当浓度的2，4-D对人参愈伤组织生长有显著的效果，最适浓度为5 mgL-1。6-BA对人参愈伤组织的生长也有一定的促进作用，以01 mgL-1生长最快。郭生祯等5。进一步比较了不同种类激素的浓度对人参愈伤组织诱导的影响。确定了诱导愈伤组织使用的激素，2，4-D起了主导作用，最适浓度为052 mgL-1，如过低或过高，诱导频率呈下降趋势；NAA对诱导愈伤组织也有一定的作用，以26 mgL-1较适宜，低于此浓度愈伤组织则很少发生；其他激素如IAA、6-

8、BA、CA等配合使用，也能获得较好的效果，但作用不显著。许多学者对影响愈伤组织诱导和生长所添加的外源激素、最适培养基、培养基的天然补充营养物质、水质等因子进行了考察。然而，人参愈伤组织生长较为缓慢，在固态培养基中操作起来较为复杂，培养物中的活性成分含量也一般大大低于天然植株，这些都大大限制了其在大规模生产中的应用。2 人参细胞悬浮培养的研究植物细胞悬浮培养的研究是植物组织培养走向工业化生产的重要步骤。与植物愈伤组织的固体静止培养相比，植物细胞液体悬浮培养的优点主要是细胞增殖速度快、能提供大量均匀一致的培养物以及能进行大规模培养。早在20世纪80年代日本就已经实现了人参细胞的大规模工业化生产。人

9、参细胞悬浮培养的研究主要包括以下几方面：优良细胞株的筛选、影响细胞生长及活性成分含量因素的探讨、诱导子的应用、活性成分的分离和化学分析、细胞培养物的药理药效学研究、生物反应器的研发以及发酵成本的降低等。对药用植物悬浮细胞培养来说，选择适宜培养基是植物细胞培养的首要条件，通过培养基中养分的调节可改变植物细胞生长及物质合成能力。在细胞培养过程中，除了物种本身特性外，还有环境中的许多物理因素，如光照、温度、pH值、电磁场等和化学因素，如培养基中碳氮磷源组成、溶氧、激素以及一些微量的金属离子等，对细胞生长和次生代谢产物的合成具有很大的影响。高日等6叫通过研究人参细胞悬浮培养过程中培养基蔗糖浓度、MS浓

10、度、氮浓度及硝态氮与铵态氮比例对细胞生长及皂苷合成的影响，发现在培养基中添加30 gL-1。蔗糖时，人参细胞合成皂苷能力最强，蔗糖浓度过低(10 gL-1)或过高(70 gL-1)均不利于细胞干重增加及皂苷积累。Ms培养基浓度减半(O5MS)或维持原浓度(10 MS)，总氮浓度为30 mm时，有利于人参细胞皂苷的合成。Ms培养基中硝态氮促进皂苷合成，单独使用硝态氮(NO3+NH4+30:0)比与铵态氮混用或单独使用铵态氮(NO3+NH4+0:30)更有利于皂苷的合成，皂苷生产量达到最高(158.9 mgL-1)。有的学者对人参细胞悬浮培养中的激素调节及细胞分裂进行了相关研究，指出在人参细胞悬浮

11、培养中，单独使用植物生长调节剂时2 mgL-12，4-D和2 mgL-1NAA的效果较好。在不同激素组合的试验中，以2 mgL-12，4-D+2 mgL-1NAA+05 mgL-1KT的效果最好7。1990年，丁家宜等人首次研究了人参培养细胞的多糖类有效成分。袁静芳等8H引在人参细胞培养物中水溶性多糖的研究中，经醋酸纤维素薄膜电泳和琼脂糖凝胶电泳，证明DPSCGl和DPSCG2均为一性多糖，两者经水解和薄层层析结果均由L-鼠李糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸等组成，但两种多糖各有一个Rr值相同的未鉴定组成成分，有待进一步研究。人参细胞悬浮培养较固体培养周期短、生长速度快、

12、皂苷含量比固体培养高都己得到了证实，这些特点也决定了其在工厂化生产上的潜力要大于固体培养。适合植物细胞培养的生物反应器的研发是实现植物细胞大规模培养的前提。目前应用于人参细胞培养生产人参皂苷的生物反应器主要有机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、固体床生物反应器以及流化床生物反应器等。为了更有利于人参细胞的培养，人们对现有反应器的搅拌形式、叶轮结构以及空气分布器进行了改进，力求在满足供氧、混合的要求的同时减小剪切力。3 人参体细胞胚胎的研究体细胞胚胎发生是单细胞或一群细胞被诱导不断再生非合子胚，并萌发形成完整植株的发育过程。在自然条件下，这个发育过程一般不可能发生，但通过组织培养，体细胞胚胎

13、发育非常频繁，成为除器官发生以外再生完整植株的又一条途径。体细胞胚胎发生技术不仅是植物快繁的重要体细胞胚胎发生技术，而且也已发展成为研究植物胚胎发生机理遗传转化的重要方法，它在研究植物形态建成的分子和细胞机制等基础研究方面还是一个重要工具，在药用植物上的应用日益受到重视。王义，赵文君，杨忠，等比较了不同外植体、植物生长调节物质种类及配比对人参体细胞胚发生的影响，建立人参胚状体培养方法并获得再生植株9-11。4 人参毛状根培养的研究近年来，我国对人参毛状根的培养也有了一定进展。徐立新等12通过向人参毛状根培养基中添加2，4-D、NAA、IBA、诱导子MJA和SA，研究了5种外源物质对人参毛状根的

14、生长量、总皂苷及单体皂苷Rb1的影响。结果表明，0.5 mgL-1的IBA能显著促进人参毛状根的生长(月增长量为50.73 gL-1)和总皂苷(质量分数为3.31)的积累，单体皂苷Rb1 (质量分数为2.293)的含量明显增大，使其在总皂苷中所占的比例增大。并且两种诱导子对人参皂苷含量的增加有明显的协调作用，当MJA与SA浓度均为0.001 nmoLL-1时，其对总皂苷和单体皂苷的积累比二者单独作用要大。陈欣等13。对人参毛状根糖基转移酶的分离纯化及酶学性质进行了相关研究，人参毛状根中提取分离了糖基转移酶，用SDS-PAGE测定其相对分子质量为566k，该酶以对羟基苯甲酸为底物时的Km=0.3

15、99 nmoLL-1，Vmax=2.74 nmolmin-1，反应的最适温度为45，最适pH值为8.0。5 人参不定根培养的研究不定根由于没有外源基因，在产品的开发方面更有优势，几年来越来越受到组织培养研究者的重视。人参不定根可以从体细胞胚胎进一步发育而形成的再生小植株上分离得到，也可以直接由人参愈伤组织诱导而来。由人参愈伤组织诱导不定根一般在MS培养基中添加适当种类和适当浓度的外源激素即可。常用来诱导人参不定根的激素为IBA(indole一3-butyric acid，IBA)。韩国在人参不定根培养的研究方面取得了重大突破，已经达到了工业化程度。Paek等14在大规模培养人参不定根生产皂苷的

16、研究中，从人参不定根的诱导到悬浮细胞的建立，再进一步从培养条件，植物生长调节剂、诱导子、不同接种量和通气量等方面考察气升式生物反应器小规模培养到扩大培养的研究，然后中式规模生产，最后，人参不定根反应器培养的规模达到了10 t。我国近年来也开始了人参不定根的组织培养研究。朴炫春等15报道了利用5 L气升式生物反应器培养人参不定根的生长周期，考察蔗糖浓度、接种量对人参不定根培养的影响，但未测定其皂苷的累积。黄滔等16对摇瓶培养人参不定根系统进行了优化。由香玲等17对小型生物反应器(310 L)培养人参不定根的生长和人参皂苷(Rg1、Re、Rb1)的累积规律，以及蔗糖浓度、初始接种量对其生长和人参皂

17、苷累积的影响进行研究。6 展望人参组织和细胞培养研究已进行了30多年，考察了各种因子(生理、环境和工程)的影响。大多数因子对人参细胞生长和皂甙生产的影响因细胞株和培养环境的不同而有显著的变化。从以前的人参细胞培养研究中获得了一些主要培养参数，这些变量决定着最佳培养条件。然而。大部分研究是基于现象观察，而不是通过理性分析而得到的。目前对各种因子和它们之间的相互作用还缺乏系统的评价方法，对它们的作用还没有足够的认识。例如，虽然营养补加能有效增强细胞生长和皂甙积累，但有关营养添加策略，尤其是基于营养成分消耗和细胞代谢变化基础上的添加策略，这方面的工作还很欠缺。这些研究对我们寻找合理有效的方法来提高产

18、量很有帮助。其他一些令人感兴趣的研究领域还包括通过代谢调节的方法来调控特定代谢物的生产。虽然人参细胞培养还只是取得了有限的商业应用，但进一步提高培养技术和增加产率会变得更具吸引力。在中国和韩国这些国家，随着土地和劳动力费用的上升。细胞培养的应用显得更为诱人。在其它方面，细胞培养产品的商业化还斋驱除人们的心理障碍，例如需要获取大众对细胞培养人参制品的支持。人参细胞培养商业化应用最终在我国如能够成功，这将为我们进一步利用植物细胞培养技术大量生产有价值的天然珍稀揎物成分的研究和开发树立极好的事例。人参组织培养在细胞培养和不定根培养方面分别在日本和韩国实现了产业化，我国作为一个资源使用和出口大国，在注

19、重人参大田栽培的同时，也应当在人参组织培养方面早日实现工业化，我们不能长久地靠砍伐山林来为世界提供廉价的人参资源，而应当在新技术的应用方面走在全国的前列。参考文献 1罗士韦，黄文徽，曹国仪，等人参组织培养J植物生理学通讯，1964，(2)：262朱蔚华，张萌麟，李新兰，等人参组织培养的研究I愈伤组织的诱导和初步培养J中草药通讯，1978，(4)：393古谷力出国考察报告-日本生物学发展概况M北京：科学文献出版社，19744朱蔚华，张萌麟，李新兰，等人参愈伤组织培养的初步研究J药学学报，1979，14(9)：5415郭生祯，李惠芝，潘景丽，等人参愈伤组织的诱导J西北植物研究，1952，(2)：1

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