第三章RNA转录.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流第三章 RNA转录.精品文档.第三章 RNA转录(RNA transcription)3.1. Basic concept3.2. Trancription survey3.3. Promoter in Eukaryotes and Prokaryotes3.4. Transcription Termination3.5. Pre-RNA processing in Eukaryotes3.1. 基本概念（P64） Basic concept 基因表达的第一步 以D. S. DNA中的一条单链作为转录的模板某一基因只以一条单链DNA 为模板进

2、行转录（不对称转录） 在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下 按A U，C G 配对的原则，合成RNA分子 模板单链 DNA的极性方向为3 5, 而非模板单链 DNA的极性方向与RNA链相同，均为5 3.DNA3-TACTCAT-5RNA 5-AUGAGUA-3 5-AUGAGUA-3（教材P64图3-1）5-ATGAGTA-3Non-template (sense strand)template (antisense strand) RNA的转录包括promotion, elongation, termination 三个阶段 从启动子（promoter）到终止子（terminator）的DNA

3、 序列称为转录单位 （transcriptional unit） 原核生物中的转录单位多为 polycistron in operon 真核生物中的转录单位多为monocistron, No operon 转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值 RNA的主要种类及功能：mRNA携带编码多肽的遗传信息 tRNA将核苷酸信息转化为aa信息 转运aa进入核糖体 rRNA参与多肽合成3.2.RNA转录概况3.2.1转录的基本过程1. 模板识别：RNApol与启动子相互识别并结合的过程（形成封闭的二元复合物） 启动子（promoter）：DNA分子上结合RNApol并形成转录起始复合物的区域，通

4、常也包括促进这一过程的调节蛋白结合位点rich A/T，易发生DNA呼吸现象形成单链区2转录起始：启动子区解链，转录起始（封闭的二元复合物 开放的二元复合物 三元复合物） 通常在这一过程中RNApol移动较慢，且易发生脱落流产式起始 决定启动子的强弱3延伸： 延伸过程中的延宕现象（Eukaryotes）：Euk genome G/C分布不均匀 脱离全酶（Pro）/RNApol脱离转录起始复合物（Euk）4终止：在终止子（terminator）处停止转录3.2.2 RNApolymerase1 RNA polymerase in Prokaryotes（以E.coli为例）1）构成 核心酶(co

5、re enzyme)：2 全酶（holoenzyme)2 ： 核心酶组建因子/ 启动子识别 ： RNA合成的活性中心 ：与共同构成活性中心 ：识别启动子，增加酶与DNA的亲和力因子可减少RNApol与非启动子DNA序列的亲和力，而增加RNApol与启动子的亲和力，一旦转录起始， 因子将脱离RNApol再次引导新的RNApol进行转录 ：参与转录终止 2） Rifamycin（利福霉素）及Streptolydigin（利链菌素）对Pro转录的影响Rif可结合，阻止NTP的进入I位点（Initiation site )（一旦形成三元复合物Rif不再起抑制作用）；利链菌素结合的延伸位点(Elonga

6、tion site)，抑制延伸。 包含两个活性中心：I位点（起始位点Initiation site） 专性结合ATP或GTP E位点（延伸位点 Elongation site ）2 RNA polymerase in Eukaryotes RNApol的种类： 酶 细胞内定位 转录产物 对-鹅膏蕈碱的敏感性 RNApol 核仁 rRNA resistant RNApol 核质 mRNA /snRNA sensitive RNApol 核质 tRNA/snRNA(U6) species specificity Alu/5sRNA 注意：线粒体和叶绿体中的RNApol类似于Prokaryotes

7、a -amanitin( -鹅膏蕈碱) RNA polII 最大亚基含有特有的羧基末端结构域（carboxy-terminal domain CTD），是以7 amino acids（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)的一致序列为单元重复序列。CTD Rich serine or threonine ，易发生磷酸化而激活RNA polII 3.3. 启动子（promoter） （P71，255）3.3.1原核生物的启动子（ promoter in Prokaryotes）现代基因的定义：合成一种蛋白质或RNA分子所需的全部DNA序列。调控序列+编码序列！ Promoter

8、 is a region of DNA involved in binding of RNA polymerase to initiate transcription.cis-action siteA cis-acting site controls the adjacent DNA but does not influence the other allele.（顺式作用位点只控制邻近DNA而不作用于其它等位序列） 启动子的信息是由其本身的序列提供的，这类通过本身结构调节同一DNA分子上相邻基因表达的DNA序列即cis-acting site（顺式作用位点）。 trans-acting fa

9、ctor（反式作用因子）：通过产生相应的RNA或蛋白质产物调控基因的表达eg 因子。 1基本结构： Consensus sequence is an idealized sequence in which each position represents the base most often found when many actual sequences are compared.1）Sextama box（-35区）：RNApol识别位点（R 位点） T85 T83 G81 A61 C69 A52 2）Pribnow box（-10区）：RNApol结合位点（B 位点） T89 A89

10、T50 A65 A100T96 3）转录起始位点（initiator、I位点） CAT 转录起始的第一个核苷酸90%是Pu（A/G），GA +1 E.coli 的CAT法则2 影响转录起始的因素1）Sextama box与Pribnow box的距离：17bp最适2） Sextama box与Pribnow box的序列 eg: Pribnow boxTATAAT 发生突变成为TACAAT 启动效率下降（down mutation 下降突变）3.3.2真核生物的启动子（ promoter in Eukaryotes）是许多相应得转录因子与启动子的元件结合后再使RNApol与启动子结合起始转录的

11、。1.RNApol:启动子分为两部分远启动子区（决定转录频率）；近启动子区（决定转录的精确起点）2 . RNApol:内部启动子（位于编码序列内部），eg：Alu序列3 . RNApol:核基因的转录1）转录起点：PyAPy（cap site）Py2CAPy5 +12）TATA box：Hogness box TATA(A/T)A 类似于pribnow box -20-30区（决定转录起点）少数基因没有TATA box3）远上游启动元件（UPE/UAS）决定转录频率，其走向不影响其功能 CAAT box：CCAAT -70 -80 （类似于sextama box） GC box：GGGCGG

12、-80-110 Enhancer（增强子）:Enhancer element is a cis-acting sequence that increases the utilization of (some) eukaryotic promoters, and can function in either orientation and in any location (upstream or downstream) relative to the promoter.（真核生物中可提高邻近启动子利用率的顺式作用序列，其功能不受位置（上游或下游）和距离的影响）Enhancer通过结合的蛋白质与P

13、romoter相互靠近而增强启动效率；Enhancer 和Promoter处于不同DNA分子时也可以通过蛋白质的相互作用而增强转录效率。Enhancer的作用特点：n 可增强转录起始效率（10200倍甚至更高）n 增强作用与其所处位置和与靶位点（promoter）的距离无关n 其序列构成为DR，核心序列（G）TGGA/TA/TA/T（G）n 其增强作用有组织特异性（需要特定的蛋白质因子才能起作用）n 其增强作用无基因专一性3.4. Transcription Termination3.4.1 终止子的种类很难判断所得到的是否为RNA终止转录区（研究终止子的难题之一）1 Terminator i

14、s a sequence of DNA, represented at the end of the transcript, that causes RNA polymerase to terminate transcription.（终止子是为RNApol提供转录终止信号的一段DNA序列，需要经过转录后形成茎环结构起作用）2 种类：intrinsic terminators/Rho-dependent terminators （不依赖 因子的终止子/依赖 因子的终止子）1） intrinsic terminators IR（茎环结构）区rich G/C3紧接着poly(U)结构RNApol在

15、terminator 处停顿 terminator与模板的结合力下降2） Rho-dependent terminators IR（茎环结构）区 G/C%减少 3紧接着poly(U)结构减少或缺失 因子：RNApol释放因子，结合mRNA 5并向3移动，当RNApol在terminator 处停顿时，因子赶上并终止转录。 具有NTPase活性3 readthrough（通读）与Polarity effect（极性效应） 通读：RNApol在终止子处不停止转录（因子在RNApol停顿时无法及时赶上或其它抗终止因子的作用）的现象即readthrough在翻译过程中核糖体越过UGA/UAG/UAA继

16、续翻译的现象也叫通读 极性效应：the effect of a mutation in one gene in influencing the expression (at transcription or translation) of subsequent genes in the same transcription unit. 基因突变对同一转录单元的下游基因表达所产生的效应。 极性效应发生的基础无义突变：编码aa的密码子突变形成终止密码。原核生物转录和翻译的同步进行 极性效应的基本过程正常情况下，核糖体从mRNA5开始翻译，阻碍因子的移动，RNApol在依赖因子的terminator

17、处通读。无义突变后，核糖体提前终止翻译， 因子得以迅速赶上RNApol，并在依赖因子的terminator处终止。3.4.2 抗终止作用（基因表达调控的手段）作用方式 破坏终止位点RNA的茎环结构attenuater 翻译过程中核糖体在terminater处停顿破坏茎环结构 也是以原核生物转录和翻译的同步进行为基础的 依赖蛋白质因子的抗终止作用 phage 抗终止蛋白N、Q在早期基因转录终止处作用于RNApol并产生抗终止作用。3.5. Pre-RNA processing in Eukaryotes 3.5.1 Pro/Euk mRNA的比较1 Prokaryotes mRNA的特点 半衰期

18、短：易被降解通常从5首先开始降解，有时其5存在茎环结构对mRNA有保护作用原核生物mRNA降解的两个阶段：n 核酸内切酶在5向3移动的核糖体后切割n 外切酶由3向5外切 通常是多顺反子结构polycistron mRNA 一般距离5较远的编码框翻译效率较差 mRNA不需要加工即可被翻译5-UTR的S-D序列（Shine-Dalgarna sequence)，是原核生物mRNA起始密码子AUG上游712Nt出存在一段rich(Pu)（AGGAGG）的区域，能被核糖体小亚基16srRNA识别并结合，可提高翻译效率。2 Eukaryotes mRNA的特点 半衰期长：不易被降解，受到一些因子的调控作

19、用eg: 酵母mRNA的降解： 外切酶去除poly(A) 去除5帽子 5向3的外切 通常是单顺反子结构monocistron mRNA 也有例外：泛素基因、bifunctional mRNA（双功能RNA） 需要加工：加帽/加尾/甲基化/剪接/编辑等3.5.2 rRNA和tRNA的加工1 rRNA基因的结构（中度重复基因） Eukaryotes:不同的rRNA串联在一起（ 以Spacer间隔） ，形成重复单元 真核生物rRNA也存在intron，需要剪接。 Prokaryotes:rRNA和tRNA相间排列(以Spacer间隔)形成重复单元2 tRNA基因的结构 Prokaryotes: tR

20、NA与rRNA共同组成operon 也存在其它operon that contain 7 tRNA genes separated by spacer sequences. Eukaryotes:与原核生物不同的是真核生物3切除后无-CCA3序列 某些真核生物tRNA存在14 nt intronSpacer和intron的差别？Spacer（间隔子）是剪接过程中从完整编码序列之间的切除的非编码序列。Intron（内含子）是剪接过程中从编码序列内部切除的非编码序列。3 加工： RNase切除spacerRNase P是一种包含有一分子RNA和一分子蛋白质的简单RNP（ ribonucleopro

21、teins ），其功能是参与tRNA的5的成熟RNase P在原核和真核生物细胞中都存在，其RNA分子在进化中高度保守RNase P的RNA组分在体外(in vitro)可内切pre-tRNA ,是一种核酶(ribozyme)Ribozyme Definition: Ribozyme is a catalytic RNA molecules that catalyze particular biochemical reactions in the absence of protein. 能在缺失蛋白质的情况下催化特异性生化反应的RNA分子.(核酶) Examples: The self-spl

22、icing of the large subunit of rRNA in Tetrahymena; nucleotide addition to the 5- or 3-end nucleotide modification on the base or the sugar moiety(P98)3.5.3 Eukaryotes hnRNA的加工heterogeneous nuclear RNA ProcessingEukaryotes hnRNA加工的形式：hnRNA是RNApolII转录的原初产物，合成后迅速被相应的protein结合形成hnRNP。 加帽：在RNApolII合成出hnR

23、NA5 2030 nt时即发生加帽 稳定hnRNA，阻碍5外切核酸酶的外切（其它：翻译、转运等）hnRNA在鸟苷酸转移酶的作用下与m7GTP作用形成5,5-磷酸二酯键，然后帽子后的核苷酸糖基进一步发生甲基化。根据甲基化的情况分为Cap0（Cap0存在于单细胞真核生物mRNA中）, Cap1（Cap1 是各类真核生物mRNA的帽子的主要形式） and Cap2. 加尾：存在加尾信号，先切除3部分序列然后加上poly(A) 稳定hnRNA，防止外切；利于转运 利于cDNA的合成、mRNA的分离及其功能的研究 多数真核生物成熟mRNA都有3poly(A)的尾巴，这类mRNA记为poly(A)+；反之

24、则为poly(A)-（ eg:Histone pre-mRNAs ） 加尾信号： 5 Cap.AAUAA.(20bases).CAUUGUGUUG signal cleavage site Poly(A) addition site GUrich region 加尾：首先CPSF 识别hnRNA加尾信号，Cf在下游发生切割，切除5002000的nt，然后poly(A) polymerase (PAP，末端腺苷转移酶)添加200个A，PBP结合polyA。 剪接： Ul, U2, U4, U5 和 U6 snRNA参与了hnRNA在核内的剪接，去除intron1）intron的种类 内含子类型

25、细胞内定位 GU-AG 细胞核，pre-mRNA(真核） AU-AC 细胞核，pre-mRNA(真核） I类内含子 细胞核， pre-rRNA (真核）, 细胞器RNA，少数细菌 II类内含子 细胞器RNA，部分细菌 III类内含子 细胞器RNA 双内含子 细胞器RNA tRNA前体内含子 细胞核，tRNA(真核）2）GU-AG型内含子的剪接（ hnRNA剪接）Because the intron defined in this way starts with the dinucleotide GT and ends with the dinucleotide AG, the junction

26、s are often described as conforming to the GT-AG rule（ GT-AG 法则， Chambon法则）snRNA与hnRNA形成剪接体，参与剪接3）I类内元的剪接G因子参与的自剪接过程。n I类内元：边界为5U-G 3 ，存在中部核心序列（ Central core strucature ）n 鸟苷（GMP、GDP、GTP）的核糖3-OH首先发动亲核攻击，打断5exon与intron5的磷酸二酯键n 游离的5端exon的3-OH再次攻击3端的exon,并与其5-P成二酯键。n 实质：转酯反应4）II类内元的剪接索套切除，由II类intron内部A

27、的糖基2-OH攻击5端exon类内含子的剪接n 结构特点： 边界序列为5GUGCGYnAG； 有6个茎环结构； 有分支点顺序（branch-point seguence）n 基本过程：无需鸟苷的辅助，但需镁离子的存在。分枝点A的2-OH对5端交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻，产生了套索（lariat）结构（图13-31）；切下的外显子1其3-OH继续对内含子3端的交界序列进行亲核进攻，同时释放出套索状的内含子。5）内含子不一定是非编码序列！I类II类的某些内含子中含有开放续框，可产生具有三种功能的蛋白。n 核酸内切酶：在DNA的靶位点剪切，使内含子得以插入；n 反转录酶：涉及将内含子RNA变成D

28、NA拷贝；n 成熟酶：从前体的RNA中切掉内含子的部分（使内含子的构象稳定）。这些蛋白可使内含子（或以其原来的DNA形式，或作为RNA的DNA拷贝）移动（mobile），使内含子可插到一个新的靶位点，这个现象叫做归巢（homing）6)多个内含子的剪接次序问题随机剪接？同时发生？ 对于特定的前体RNA而言，内含子的剪接是按照特定的顺序发生的！ 内含子的剪接取决于前体RNA分子的构象：u 首先由于特定的构象发生某一内含子的剪接；u 然后该中间体再次形成特定构象而剪接相应的内含子；u 依此类推完成全部内含子的剪接剪接不一定从第一个内含子起始的！7）Alternative splicing（可变剪接

29、）50%的基因有这种剪接方式部分的解释为什么出现C-value paradox剪接过程中选择性的保留或去除hnRNA中的某些序列（可能是存在多个 polyA添加位点、或存在多个promoter位点；也可能是exon或intron的选择性保留）8）trans splicing（反式剪接）分子之间的一种剪接方式：不同分子的exon相互连接形成新的分子比较少见！ 编辑：有些hnRNA剪接后 不能立刻用于翻译，还要进行某些碱基的添加、删除或替换即RNA editing 包括：U的添加或删除、 C 替换成 U 、A替换成G eg:神经细胞Gln受体蛋白A to G 载脂蛋白B 在小肠内第2153个密码由

30、CAA替换成了（第6666 位碱基），产物由512 kDa 变成241 kDa（胞嘧啶脱氨酶的作用） 纤毛虫：线粒体中cytochrome b gene与其cDNA比较发现其3位点添加了UgRNA（guide RNA）的作用U的添加和切除：n gRNA从3与pre-RNA配对n 在不配对处有核酸内切酶切开RNAn TUTase或3U-exo添加或切除U，使pre-RNA与gRNA配对 遗传学效应： n proofreading ；（校正）n translation regulation；（翻译调节）n expanded genetic information.（扩充遗传信息） 修饰 ： met

31、hylation（甲基化）脊椎动物体内通常mRNA A的N6发生甲基化（约有0.1%)这些位点的甲基化很保守，但功能未知3.1. Basic concept（转录的基本原则；转录复制的比较）3.2. Trancription survey（转录的基本概况过程、RNApol）3.3. Promoter in Eukaryotes and Prokaryotes（promoter 结构，及各部分的作用；原、真核生物的比较）3.4. Transcription Termination（终止子结构、种类；抗终止作用；极性效应等）3.5. Pre-RNA processing in Eukaryotes

32、（加工rRNA 、tRNA 、hnRNA的加工；原、真核生物mRNA的比较）Question:1 名词：trans splicing 、alternative splicing、 enhancer、 terminator、 promoter、S-D sequence、read through、gRNA、RNA editing、Ribozyme2 转录的基本过程，试比较生物体复制与转录的异同3原核生物RNApol的基本构成及各亚基的功能4真核生物RNApol 的种类及各自的转录产物5原核生物一般的gene promoter结构特点及各部分的功能6真核生物启动子的种类与各自的结构7终止子种类及异同；终止机制如何？8极性效应的产生机理9真核生物、原核生物mRNA的异同10真核生物hnRNA加工的种类11RNA splicing的基本机理（三种）