酸溶蛋白和粗蛋白测定.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流酸溶蛋白和粗蛋白测定.精品文档.油 脂 的 检 验 与 分 析粗蛋白质的测定（凯氏半微量定氮法）测定原理 凯氏法的基本原理是将含有蛋白质的样品与浓硫酸共热使其分解，其中氮元素变成铵盐。再经浓碱液作用，放出的氨气经硼酸吸收后用盐酸标准溶液滴定硼酸溶液所吸收的氨。计算出试样含氮量，乘以相关的蛋白质换算系数，即得打蛋白质的含量。 消化：蛋白质与浓硫酸混合加热，蛋白质被炭化分解，其中碳被氧化成二氧化碳，所含的氮则转变成硫酸铵残留于消化液中。 有机物（含N、C、H、O、P、S等元素）+H2SO4CO2 (NH4)2SO4H3PO4SO2SO3由于上述反

2、应进行的很慢，消化需要很长时间，加入催化剂可加速反应。硫酸铜是备用的催化剂，硫酸钾能提高硫酸的沸点，常将它们混合使用，起加速氧化、促进有机物分解的作用。蒸馏：消化所得的硫酸铵加碱蒸馏，氨就被释放出来。 (NH4)2SO4 2NaOH2 NH3H2O Na2SO4 NH3H2ONH3H2O生成的氨用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后，指示剂颜色变化，再用盐酸滴定，直至恢复到原来的氢离子浓度为止，盐酸与样品中氨是等摩尔反应。 2NH34 H3 BO3(NH4)2 B 4O75H2O (NH4)2 B 4O72 HCl 5H2O 2NH4Cl 4H3 BO3 由于各种蛋白质的含氮量通常为16左右，将含氮量乘

3、以蛋白质系数，即为粗蛋白质含量。试剂 浓硫酸过氧化氢水混合液（231）。在100mL水中缓慢加入浓硫酸200mL，冷却后加入30过氧化氢300mL，混匀备用，此液存放阴凉处可保存一个月。混合催化剂。10g硫酸铜（Cu SO45H2O）、100g硫酸钾、0.2g硒粉，在研钵中研细，通过孔径0.45mm筛，混匀后备用。40g/100mL氢氧化钠溶液、2硼酸溶液、0.01mol/L盐酸溶液。甲基红乙醇溶液：称取0.1g甲基红置于研钵中，加入少许95乙醇，研磨溶解后加入75mL95乙醇。次甲基蓝乙醇溶液：0.1g次甲基蓝溶于80mL95乙醇中，临用时将以上两液按2：1比例混合即成。在酸域呈紫红色，PH

4、5.5时无色，在碱域呈绿色。仪器 50mL凯氏烧瓶、1000mL圆底烧瓶、100mL锥形瓶、5mL(刻度0.01mL)微量滴定管、50mL容量瓶、5mL移液管、凯氏蒸馏装置。操作方法 消化。用长条光滑纸称取试样0.20.3g，精确到0.0001g（约含粗蛋白质1030mg）直接送入凯氏烧瓶底部，加混合催化剂1g，同时加入硫酸过氧化值水混合液35mL，稍加振摇，斜置于电炉上。在通风橱内加热进行消化。开始时用低温加热，切勿使瓶中泡沫超过瓶肚的2/3，待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度保持微沸。直至消化液呈浅蓝绿色的透明状时再继续加热沸腾10min，取出，待消化液冷却至室温后，加水至1020mL。溶液

5、温度降到室温后，将消化液移入50mL容量瓶中，并用少量水将凯氏烧瓶冲洗34次，洗涤液一并移入容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀备用。蒸馏。凯氏微量蒸馏装置它是由蒸汽发生器、反应瓶、及冷凝管等组成，在大烧瓶8（容量1000 mL）中加入蒸馏水400mL和少量碎玻璃片，加5滴混合指示剂，加几滴酸液，使水呈紫红色，盖紧瓶塞，连接4、1、2并检查有无漏气。量取30mL2硼酸溶液，注入（100mL）三角瓶3内，作为承接器，加混合指示剂12滴（溶液呈紫红色），置于冷凝管2下面，使管尖端插入硼酸溶液1cm深处。用5mL移液管吸取5mL（V）试样稀释液，由漏斗5注入蒸馏瓶1内，再倒入蒸馏水10mL冲洗漏斗5。接着

6、量取40g/100mL氢氧化钠溶液10mL，由漏斗5注入蒸馏瓶1内，再用25mL水冲洗漏斗5，旋紧活塞，此时蒸馏瓶1内溶液总体积应不超过容积的一半。打开电炉加热烧瓶8，打开簧夹7，关闭活塞6，使蒸汽通过回流管4进入蒸馏瓶1再由蒸馏瓶1经冷凝管2而流入三角瓶3，待三角瓶3内的溶液呈绿色时，开始记录时间，经23min后,将三角瓶3放低，使冷凝管2下端离开液面，继续蒸馏1min，然后用少量无CO2蒸馏水冲洗冷凝管2下端，蒸馏即告结束。蒸馏结束后，旋紧簧夹7断绝蒸汽。这时由于回流管4内蒸汽压立即降低，所以蒸馏瓶1内的液体则全部吸入回流管4内。然后打开漏斗5下的簧夹，注入蒸馏水4050mL于蒸馏瓶1内，

7、关闭漏斗5下的簧夹，打开簧夹7，通入蒸汽加热洗涤蒸馏瓶1，再断绝蒸汽，使洗涤回流至回流管4中，打开活塞6，将回流管4中废液弃去，关闭活塞6，为下次蒸汽做好准备。滴定。用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定三角瓶3中的吸收液至出现淡紫色为止。记录所消耗盐酸标准溶液的体积（V1）。空白试验除不加试样外，消化、蒸馏、滴定操作与样品相同。结果计算 粗蛋白质的干基含量按下式计算： （V2V1）c0.01406.25 W（）100Vm V 式中V2-滴定试样时所需标准盐酸溶液的体积，mL； V1-滴定空白时所需标准盐酸溶液的体积，mL； c-盐酸标准溶液浓度，mol/L； m-试样的质量，g； V-试样分解液总体积，mL；V-试样分解液蒸馏用体积，mL；0.0140-与1.00mL盐酸标准溶液c（HCl）1.000mol/L相当的以克表示的氮的质量。6.25-氮换算成蛋白质的平均系数。双实验结果允许差：粗蛋白质含量在15以下时，不超过0.2；粗蛋白质含量在15以上时，不超过0.4。求其平均数，即为测定结果，测定结果取小数点后一位粗蛋白质（）