各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看).doc

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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看)各种酶切位点的保护碱基各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (ol

2、igonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 g已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM M

3、gCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。酶寡核苷酸序列链长切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 90 900 90 90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8

4、10 1290 90 9090 90 90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 90 9090 90 90BamH ICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 90 9025 90 90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 90 90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 90BstE IIGGGT(A/T)ACCC9010BstX IAACTGCAGAAC

5、CAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 90 500 0 90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 1290 90 9090 90 90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 1290 90 9090 90 90Hind IIICAAGCTTG CC

6、AAGCTTGG CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 90 900 90 90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco ICCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC8 10 12 18 20 220 0 0 0 75

7、 750 0 0 0 90 90Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT12 2210 9090 90Pac ITTAATTAA GTTAATTA

8、AC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24 260 10 90 90 00 10 90 90 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCG

9、A8 10 120 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG81010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT8 1210 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 120 0 10 901

10、0 10 50 90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410 10 0 090 90 50 50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 1290 90 9090 90 90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 90 75 750 90 90 90Xho I

11、CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG8 10 120 10 100 25 75Xma ICCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA8 10 12 140 25 50 900 75 90 902.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37进行同步酶切。但BamH I在37下

12、有时表现出star活性，常用30单切。两个酶切位点相邻或没有共同 buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。3.酶切底物DNA，切不开1）底物DNA上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。2）PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。3）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的DNA，同样量，用不同的限制酶切情况可能不同，由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA，不

13、同的反应体系，酶切效果也可能不同，由于一些空间因素或不可测因素造成的。4）公司出售的限制酶都是液体状态，都是根据最佳反应体系配制了浓度，不可以再用buffer稀释，因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物DNA不能被切断的现象。不同公司的酶和buffer不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。5）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶，或将质粒DNA转入甲基化酶欠损的宿主菌中，重新制备DNA，也可以使用PCR的方法对DNA进行扩增，再做酶切。常用的有XbaI容易受甲基化影响，通常选用GM33做宿主菌转化。6）底物不纯，含有限制酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化DNA。一般做乙醇沉淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。4.DNA经酶切后，电泳无带或出现smear现象DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase的作用，将DNA降解。可以用DNA上的其他酶，也可以用此酶切其他DNA来检查问题所在。如果质粒酶切出现此情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。 5.甲基化酶M.Alu I, M.Bam H I, M.RcoR I不属于CG甲基化，dam甲基化，也不属于dcm甲基化。甲基化酶作用后，DNA不能被相应的酶切断。-