实验35过氧化氢酶的活性测定.doc
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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date实验35过氧化氢酶的活性测定植物在逆境下或衰老时,由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸,蛋白质等生物大分子,并使细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此,植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量,利用
2、高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。植物在逆境下或衰老时,由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸,蛋白质等生物大分子,并使细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此,植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量,利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。一、过氧化氢含量的测定【原理】H2O2与硫酸钛(或氯化钛)生成过氧化物钛复合物黄色沉淀,可被HSO4溶解后,在415nm波长下比色测定。在一定范围内,其颜色深浅与H2
3、O2浓度呈线性关系。【仪器和用具】研钵;移液管0.2ml2支,5ml1支;容量瓶10ml7个,离心管5ml8支;离心机;分光光度计。【试剂】100mol/L H2O2丙酮试剂:取30%分析纯H2O2 57l,溶于100ml,再稀释100倍;2mol/L硫酸;5%(W/V)硫酸钛;丙酮;浓氨水。 【方法】 1.制作标准曲线:取10ml离心管7支,顺序编号,并按表40-1加入试剂。表40-1 测定H2O2浓度标准曲线配置表试剂(ml)离 心 管 号1234567100mol/L H2O200.10.20.40.60.81.04下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10
4、.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.2 3000r/min 离心10min,弃去上清夜,留沉淀2mol 硫酸5.05.05.05.05.05.05.0 待沉淀完全溶解后,将其小心转入10ml容量瓶中,并用蒸馏水少量多次冲洗离心管,将洗涤液合并后定容至10ml刻度,415nm波长下比色。 2.样品提取和测定:(1)称取新鲜植物组织25g(视H2O2含量多少而定),按材料与提取剂11的比例加入4下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后,转入离心管3000 r/min下离心10min,弃去残渣,上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml,按表35-1加
5、入5%硫酸钛和浓氨水,待沉淀形成后3000rpm/min离心10min,弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤35次,直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml,待完全溶解后,与标准曲线同样的方法定容并比色。 3.结果计算: 植物组织中H2O2含量(mol/g Fw)=式中 C标准曲线上查得样品中H2O2浓度(mol); Vt样品提取液总体积(ml); V1测定时用样品提取液体积(ml); FW植物组织鲜重(g)。二、过氧化氢酶的活性测定高锰酸钾滴定法 【原理】过氧化氢酶(CAT)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧
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