PCR法获取目的基因解析.ppt

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1、PCR技术 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) PCR技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。 在生物学实验中做为基础存在，可以说是现代分子生物学研究中最重要的技术。 1.Khorana1.Khorana等等19711971年提出在体外经年提出在体外经DNADNA变性、变性、与适当引物杂交、再用与适当引物杂交、再用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸, ,克隆克隆DNADNA的设想。的设想。2.19832.1983年年,Mullis,Mullis发明了发明了PCRPCR技术技术, ,使使KhoranaKhorana的设想

2、得到实现。的设想得到实现。3.19883.1988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技术。技术。 4.19884.1988年，第一台年，第一台PCRPCR仪问世。仪问世。5.19895.1989年美国年美国ScienceScience杂志比喻杂志比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis荣获荣获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。在微量离心管中在微量离心管中,加入加入适量的缓冲液适量的缓冲液, 微量的模微量的模板板DNA,四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸,耐热性耐热性DN

3、A聚合酶聚合酶, 一对一对合成合成DNA的引物的引物,通过高通过高温变性、低温退火和中温温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成延伸三个阶段的循环合成DNA，每一次循环使特异，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过倍。一般样品经过30次循次循环环,可使基因的拷贝数达可使基因的拷贝数达到数百万。到数百万。 （1）类似于）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在在 （3）重复）重复“变性变性-退火退火-延伸延伸”的循环，可获得大量的新的循环，可获得大量的新DNA链，而链，而且这种新链又可成为

4、下次循环的模板，从而指数级地获得大量且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。（2）PCR过程：由变性过程：由变性复性（退火）复性（退火）-延伸三个延伸三个基本反应步骤构成基本反应步骤构成 变性：变性：94左右，使双链左右，使双链DNA模板解离成为模板解离成为单链；单链； 复性：复性：55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链互补单链互补配对结合；配对结合； 延伸：延伸：72左右，左右，“模板模板-引物结合物引物结合物”在在DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶

5、序为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的新的DNA链链PCR排管扩增出的目标基因转移点样进行电泳扩增出的目的基因PCR技术的注意事项1.合理分隔实验室合理分隔实验室将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。2.吸样枪吸样枪由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 3.试剂分装试剂分装所有的PCR试

6、剂都应小量分装，-20保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂和PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存。4.防止操作人员污染防止操作人员污染一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。 33 荧光定位PCR技术（FQ-PCR）FQ-PCR的工作原理是利用Taq 酶的5 3外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5端标以荧光报告基团，靠近3端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能量传递结构。当PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物是一对一的关

7、系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号,实现了仪器实时检测，为新的PCR定量原理创造了条件。PCR技术的应用举例： 研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结 合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱法医：犯罪现场标本分析，DNA检测比对，DNA安保标记。 医疗：肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤等癌症的筛查。 组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究。 古生物学：考古与博物馆标本分析。 动物学：动物传染病的诊断等。 植物学：检测植物病原等。PCR技术的未来展望 到2030年，由于基因技术的空前发展，一个人的全部基因组序列可能只需要1000美元就能得到。 基因定制，基因医疗，基因药物都不会再是设想，而将逐渐成为现实，而这一切，都建立于PCR技术所树立起来的基础之上。随着技术发展，个人基因信息也许会成为新的重要隐私。