最新原生质体的分离与融合1幻灯片.ppt

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1、什么是原生质体什么是原生质体 原生质体，是指出去细胞壁的植物细胞的部分。原生质体，是指出去细胞壁的植物细胞的部分。由由Hanstein 1980年提出年提出在适当条件下，原生质体可以成功培养长出细胞壁，并通过细在适当条件下，原生质体可以成功培养长出细胞壁，并通过细胞分裂。胞分裂。原生质体不仅对细胞融合研究有价值，且能通过裸露的质膜获原生质体不仅对细胞融合研究有价值，且能通过裸露的质膜获得外源得外源DNA、细胞器、细菌和病毒颗粒等。、细胞器、细菌和病毒颗粒等。3）纯化（上浮法和下沉法）纯化（上浮法和下沉法）上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23%左右）混合。左

2、右）混合。下沉法是讲原生质体与下沉法是讲原生质体与13%的甘露醇混的甘露醇混合，然后加到合，然后加到23%的蔗糖溶液顶部，形的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。成一个界面。两种方法中，均在离心两种方法中，均在离心510分钟后，在分钟后，在蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。用蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。用吸管将带轻轻吸出来，悬浮离心，稀释吸管将带轻轻吸出来，悬浮离心，稀释后用于培养。后用于培养。二、影响原生质体分离的因素二、影响原生质体分离的因素5 原生质体的活力测定和密度原生质体的活力测定和密度 原生质体的真正活力使原生质体有能力通过持续有原生质体的真正活力使原生质体有能力通过持续有丝分裂，再生成

3、愈伤组织，并最终再生成植株。丝分裂，再生成愈伤组织，并最终再生成植株。 测定原生质体活力的方法主要有：测定原生质体活力的方法主要有：FDA（荧光素二乙（荧光素二乙酸）染色法；酚藏红花（酸）染色法；酚藏红花（CFW）染色法；测定呼吸强）染色法；测定呼吸强度法等。度法等。影响原生质体分离的因素影响原生质体分离的因素6 培养基成分培养基成分 培养基中应当去除铵，因为它对原生质体的生存是有害的，培养基中应当去除铵，因为它对原生质体的生存是有害的，而铁、锌的含量也应当减少。另外，钙的浓度应当比通常培养而铁、锌的含量也应当减少。另外，钙的浓度应当比通常培养细胞所需的细胞所需的 浓度增加浓度增加24倍，提高

4、钙的浓度能改善膜的稳定性。倍，提高钙的浓度能改善膜的稳定性。 葡萄糖是最好最可靠的碳源，其次为蔗糖。葡萄糖是最好最可靠的碳源，其次为蔗糖。7 环境因子环境因子 一般来说，刚开始培养时高光强会抑制原生质体的生长，一般来说，刚开始培养时高光强会抑制原生质体的生长，因此应先在黑暗或弱光下培养几天，再将其转移到一般光强下因此应先在黑暗或弱光下培养几天，再将其转移到一般光强下培养。温度范围培养。温度范围2028度适宜，度适宜，pH范围范围5.55.9适宜。适宜。三、原生质体培养三、原生质体培养原生质体培养原生质体培养1. 液体浅层培养（液体浅层培养（Liquid thin layer culture）原

5、生质体纯化后，将原生质体悬浮于液体培养基中，取少许于原生质体纯化后，将原生质体悬浮于液体培养基中，取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口培养。培养皿底部形成很薄的一层，封口培养。2. 固体培养（固体培养（Solid culture）也叫琼脂糖平板法或包埋培养法。将原生质体悬浮于液体培养也叫琼脂糖平板法或包埋培养法。将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂（琼脂或琼脂糖）按一定比例混合，在培养皿基后，与凝固剂（琼脂或琼脂糖）按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。底部形成一薄层，凝固后封口培养。3. 固液双层培养法（固液双层培养法（Solid over liquid culture

6、）即先在培养皿底部铺一层固体培养基，待凝固后再在其上进行液体浅层培养。即先在培养皿底部铺一层固体培养基，待凝固后再在其上进行液体浅层培养。固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收。产生的有毒物质可以被固体培养基吸收。细胞再生细胞再生 （1）细胞壁形成）细胞壁形成不同植物原生质体再生细胞壁所需时间不一样，从几小时到几天。原生质体不同植物原生质体再生细胞壁所需时间不一样，从几小时到几天。原生质体失去其圆球形特征表明了新细胞壁的再生。简单鉴别壁再生的方法是用荧光失去其圆球形特

7、征表明了新细胞壁的再生。简单鉴别壁再生的方法是用荧光增白剂（增白剂（CFW）染色法检测到。）染色法检测到。（2）细胞分裂）细胞分裂第一次细胞分裂一般发生在第一次细胞分裂一般发生在27d内，分裂活跃的细胞悬浮培养的原生质体与内，分裂活跃的细胞悬浮培养的原生质体与叶片高度分化细胞的原生质体相比，前者进入第一次细胞分裂较快。叶片高度分化细胞的原生质体相比，前者进入第一次细胞分裂较快。（3）植株再生）植株再生具有再生能力的原生质体就会不断分裂形成多细胞团。当细胞团进一步发育具有再生能力的原生质体就会不断分裂形成多细胞团。当细胞团进一步发育成为肉眼可见的小愈伤组织，要及时转移到分化培养基（成为肉眼可见的

8、小愈伤组织，要及时转移到分化培养基（Differentiation medium）中，培养与再生过程同一般的愈伤组织培养。）中，培养与再生过程同一般的愈伤组织培养。体细胞杂交体细胞杂交 离体条件下，通过分离体细胞原生质体融合产生杂合离体条件下，通过分离体细胞原生质体融合产生杂合体，再通过其异核体的发育形成杂种植株的技术被称体，再通过其异核体的发育形成杂种植株的技术被称为为体细胞杂交体细胞杂交。这个程序消除了杂交中性别因素。克服不亲和性障这个程序消除了杂交中性别因素。克服不亲和性障碍，成为植物基因的遗传操作方法。碍，成为植物基因的遗传操作方法。在体细胞杂交中，亲本的细胞核和细胞质在杂种细胞在体细

9、胞杂交中，亲本的细胞核和细胞质在杂种细胞中融合了。有时，融合的杂合体中只有一个亲本的核中融合了。有时，融合的杂合体中只有一个亲本的核基因，而有两个亲本的细胞质基因，这样的杂种叫胞基因，而有两个亲本的细胞质基因，这样的杂种叫胞质杂种。质杂种。体细胞杂交体细胞杂交 物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了很多物种、属间，甚至

10、科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。一些自然界不存在的植物类型。 原生质体融合技术体系大致包括三大环节：原生质体融合技术体系大致包括三大环节：v诱导原生质体融合诱导原生质体融合v选择融合体或杂种细胞选择融合体或杂种细胞1.杂种植株的再生与鉴定杂种植株的再生与鉴定(一一) 原生质体融合原生质体融合 原生质体融合（原生质体融合（Protoplast fusion）是指不同种类的原生）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。1 自然融合（自然融合（Spontaneous fusion） 来源于分裂旺盛

11、细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达孢子来源的原生质体融合率可高达5070%。实际上自然条件下。实际上自然条件下受精就是一种自发融合受精就是一种自发融合。(一一) 原生质体融合原生质体融合2 诱发融合诱发融合1) NaNO3处理法处理法 Power 于于1970年采用年采用NaNO3溶液诱导燕麦与玉米根尖原生质体溶液诱导燕麦与玉米根尖原生质体融合，首次得到融合体。融合，首次得到融合体。1972年，美国学者年，美国学者Carlson等采用此法获等采用此法获得郎氏烟草与粉蓝得郎氏烟草与粉蓝 烟草体细胞杂种，这是植物

12、中首例体细胞杂种。烟草体细胞杂种，这是植物中首例体细胞杂种。 缺点是缺点是Na+造成膜电位的改变。融合频率低。造成膜电位的改变。融合频率低。2) 高高pH-高钙法高钙法 Keller和和Melchers于于1973年报道采用高浓度年报道采用高浓度Ca2+的强碱溶液的强碱溶液处理烟草叶肉原生质体，可以使融合频率大幅度增加，达到处理烟草叶肉原生质体，可以使融合频率大幅度增加，达到50%。之后，采用此方法成功获得了烟草种间和属间体细胞杂。之后，采用此方法成功获得了烟草种间和属间体细胞杂种。种。3)水溶性多聚体水溶性多聚体聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法 最成功的原生质体融合技术。最成功的原生质体融

13、合技术。1976年年Kao发现用含高浓度发现用含高浓度Ca2+的强碱溶液清洗的强碱溶液清洗PEG诱导和原诱导和原生质体时，融合频率得到到进一步提高，因而发展起高生质体时，融合频率得到到进一步提高，因而发展起高pH-PEG法。法。PEG诱导小麦与玉米融合产生不育杂种诱导小麦与玉米融合产生不育杂种4)电融合法（电融合法（Electrofusion）主要是双向电泳法，其基本原理：主要是双向电泳法，其基本原理：与与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技

14、术操作简便。电融合的基本过程：电融合的基本过程：v细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；子，从而使原生质体紧密接触排列成串；a.膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一

15、起。的细胞融合在一起。体细胞杂种的特点体细胞杂种的特点 形态上的趋中性形态上的趋中性 变异幅度大变异幅度大 非整倍性非整倍性 双亲性状的共显性双亲性状的共显性 偏亲现象偏亲现象杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定 1杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统 外观选择外观选择 互补选择互补选择 荧光标记选择荧光标记选择2体细胞杂种的鉴定体细胞杂种的鉴定任何两个种的原生质体都可以融合在一起。然而，高等植物体任何两个种的原生质体都可以融合在一起。然而，高等植物体细胞杂交的广泛利用收到一些限制，包括非整倍体、杂交的种细胞杂交的广泛利用收到一些限制，包括非整倍体、杂交的种障碍

16、和不可能从原生质体再生成植株等。障碍和不可能从原生质体再生成植株等。杂种性的鉴定要求有证明两个融合亲本遗传贡献的清楚证据，杂种性的鉴定要求有证明两个融合亲本遗传贡献的清楚证据，而杂种性只能来源于整倍体，而不能来源于非整倍体。而杂种性只能来源于整倍体，而不能来源于非整倍体。形态鉴定：根据双形态鉴定：根据双亲的形态学性状观亲的形态学性状观察进行鉴定。察进行鉴定。杂种在形态上往往杂种在形态上往往介于双亲之间，包介于双亲之间，包括株型、叶形、花括株型、叶形、花器官等器官等细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。染色体计数：染色体数目是双亲之和，或少染色体计数：染色体数目是

17、双亲之和，或少1至几条染色体。所至几条染色体。所以，细胞融合可以创造非整倍体。代换系、染色体片段置换系以，细胞融合可以创造非整倍体。代换系、染色体片段置换系等珍贵的遗传学研究材料。这些遗传材料对于基因定位、确定等珍贵的遗传学研究材料。这些遗传材料对于基因定位、确定染色体与分子标记连锁群的关系、育种等有重要应用价值。染色体与分子标记连锁群的关系、育种等有重要应用价值。生化鉴定：同功酶鉴定生化鉴定：同功酶鉴定分子鉴定：分子鉴定：RFLP鉴定、鉴定、RAPD标记鉴定标记鉴定是最有效的检测手段，尤其是细胞学无法确定是杂种是最有效的检测手段，尤其是细胞学无法确定是杂种的时候，分子标记更有用，它能检测出遗

18、传物质的细的时候，分子标记更有用，它能检测出遗传物质的细小重组。小重组。体细胞杂种的遗传特性体细胞杂种的遗传特性 1细胞分裂与染色体丢失细胞分裂与染色体丢失 如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡；两种结果，一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。如果这二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。如果这样就会产生几种情况：样就会产生几种情况：A细胞细胞B细胞质；细胞质；A细胞细胞B细胞质和部细胞质和部分染色体或基因。分染色

19、体或基因。 体细胞杂种的遗传特性体细胞杂种的遗传特性 2基因转移与性状表达基因转移与性状表达 由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，其结果是实现了亲本间的基因转另一亲本的染色体发生整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于基移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。 3体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种遗传上的不稳定性 体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多

20、方面体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。核、细胞质遗传物质的重组等。体细胞杂种的应用体细胞杂种的应用一、体细胞杂种的应用潜力一、体细胞杂种的应用潜力1、 植物育种中的核质替换植物育种中的核质替换2、 细胞质杂种的获得细胞质杂种的获得3、 远缘杂交创造新物种远缘杂交创造新物种4、 细胞器的互作研究细胞器的互作研究体细胞杂种的应用体细胞杂种的应用二、体细胞杂交面临的困难二、体细胞杂交面临的困难1、 融合特性的高效性融合特性的高效性2、 杂种细胞的培养和选择杂种细胞的培养和选择3、 杂种的遗传稳定性控制杂种的遗传稳定性控制体细胞杂种的应用体细胞杂种的应用三、体细胞杂交研究的发展趋势三、体细胞杂交研究的发展趋势1、 诱导融合及杂种细胞的各种生理、生化、遗诱导融合及杂种细胞的各种生理、生化、遗传机理的研究传机理的研究2、 电融合的程序化控制研究电融合的程序化控制研究3、 各种类型原生质体（胞质体、核质体、细胞各种类型原生质体（胞质体、核质体、细胞器）的制备技术研究器）的制备技术研究4、 杂种细胞培养技术的程序化研究杂种细胞培养技术的程序化研究38 结束语结束语